ДНК-діагностика та днк-типірування
Мал. ІІ.30. Генетичні наслідки мутацій, що відбуваються в геномі соматичних клітин людини на різних стадіях ембріогенезу
Чорним кольором зафарбовано місця локалізації клонів мутантних клітин різних розмірів в організмі людини
Дослідження показують, більшість захворювань людини, і, можливо, і його хвороби пов'язані з мутаціями, які призводять до зміни рівнів експресії конкретних генів. Мутації у певних генах порушують функціонування біохімічних систем, що зрештою призводить до розвитку відповідних патологічних станів організму (рис. II.30). У тому випадку, якщо мутації відбуваються в геномі клітин зародкової лінії людини, всі соматичні клітини організму-нащадка, що розвивається з мутантної зиготи, що утворилася від злиття мутантних гамет у процесі запліднення, будуть містити вказану мутацію. Чим пізніше в онтогенезі людини виникає соматична мутація, тим менший розмір клону мутантних клітин у дорослому організмі. Якщо мутація домінантна, тобто. патологічний мутантний ознака, що визначається мутантним геном, проявляється навіть за наявності в соматичних клітинах копії нормального гена, отриманого від іншого батька, виникає спадкове захворювання.
У випадках, коли мутація, що визначає мутантний фенотип, рецесивна (її дія проявляється лише в гомозиготному стані, при якому один і той же мутантний ген отриманий від кожного з батьків), можна говорити про схильність організму-гетерозиготи до відповідного захворювання таносійствімутантного гена. Дійсно, організм, у якого дія рецесивної мутації маскується функціонуванням іншого, повноцінного алелю, зовні (фенотипно) виглядає нормальним. Однак у такогоорганізму набагато більше шансів дати хворе потомство у шлюбі з носієм такого ж мутантного гена, що є однією із причин заборони на близькі споріднені шлюби. З іншого боку, у носіїв мутантних генів у гетерозиготному стані може статися соматична мутація у відповідному алельному гені соматичних клітин, що також спричинить розвиток набутого генетичного захворювання. Як один із прикладів такого захворювання ми вже розглядали раніше ретинобластому – онкологічне захворювання, що вражає сітківку очей, найчастіше, у дитячому віці. Це захворювання розвивається у два етапи: спочатку організм дитини отримує від одного з батьків мутантний генRB1, що є рецесивним онкогеном (антіонкогеном), а потім в онтогенезі в одній із соматичних клітин в результаті мутації відбувається інактивація другої його копії, що викликає малігнізацію клітини та розвиток пухлини. Такий самий механізм лежить в основі виникнення деяких форм діабету, а також ряду онкологічних та аутоімунних захворювань.
Традиційна діагностика спадкових та інфекційних захворювань будується на детальному вивченні симптомів та проведенні численних біохімічних аналізів, включаючи культивування патогенних мікроорганізмів на складних поживних середовищах. При цьому виявлення безсимптомного носійства шкідливих алелів та мікроорганізмів-збудників перетворюється на надзвичайно трудомістке завдання. Зокрема, традиційними цитогенетичними методами можна виявити в геномі людини лише деякі великі хромосомні перебудови: протяжні делеції та транслокації генетичного матеріалу, втрату чи придбання цілих хромосом. При цьому дрібні делеції, транслокації та вставки, а також точкові мутації, які є найбільш часто зустрічаютьсязмінами генетичного матеріалу залишаються не виявленими. Те саме має місце і при діагностиці безсимптомного носія збудників інфекційних захворювань бактеріальної та вірусної природи, наприклад вірусу імунодефіциту людини, які в латентній стадії інфекції можуть бути присутніми в організмі людини лише в невеликій кількості копій.
Розроблені недавно нові методи молекулярної біології, і особливо метод ПЛР, значно полегшили проведення діагностики спадкових та інфекційних захворювань. При цьому мутації виявляються у ДНК клінічних зразків, а безсимптомна присутність збудників виявляють за наявністю геномних ДНК чи РНК відповідних вірусів чи бактерій.
В основі всіх методів ДНК-діагностики лежать три фундаментальні принципи молекулярної біології (рис. II.31). Це насамперед існування комплементарних взаємодій між дволанцюжковими молекулами нуклеїнових кислот (перший принцип), які після денатурації з наступною ренатурацією (другий принцип) дозволяють їм безпомилково знаходити один одного та відновлювати початкову вторинну структуру. Якщо ж в процесі ренатурації нуклеїнових кислот додати в проби короткі олігонуклеотиди (зонди або праймери), ковалентно з'єднані з будь-яким міченим з'єднанням, то вони завдяки комплементарним взаємодіям з'єднуються з тією ділянкою нуклеїнової кислоти, який містить послідовність нуклеотидів праймер (третій принцип). Отже, наявність мітки, що зв'язалася з нуклеїновою кислотою, з високою точністю свідчить про присутність в аналізованому зразку шуканих послідовностей нуклеотидів.
Мал. ІІ.31. Три молекулярно-генетичні принципи, що лежать уоснові ДНК-діагностики
Зірочками відзначено наявність радіоактивної, флуоресцентної або іншої мітки в олігонуклеотидних зондах або праймерах на одному з кінців
Сучасні методи ДНК-діагностики знаходять широке застосування в медицині для виявлення мутацій при спадкових (або набутих) захворюваннях та ДНК-типування організмів (рис. II.32). ДНК-діагностика спадкових та набутих захворювань може полягати як у виявленні відомих, вже описаних мутацій, так і у пошуку нових мутацій, що призводять до того ж патологічного стану організму.ДНК-типуваннямназивають пошук генотипичних особливостей у мікро- або макроорганізму, які дозволяють його ідентифікувати та (або) віднести до тієї чи іншої систематичної групи.
Мал. ІІ.32. Застосування методів ДНК-діагностики у медицині