Оптогенетика найсвітліші думки, Наука та життя
Павло Єлізар'єв, Інститут біології гена РАН
Близько десяти років тому в дослідників з'явився унікальний інструмент вивчення нервових клітин.
Мозок складається з мільярдів клітин - нейронів, організованих у складні мережі. Слідкувати за роботою окремих груп нейронів важко, ще складніше ними керувати. Проте близько десяти років тому в дослідників з'явився унікальний інструмент вивчення нервових клітин. Тепер включати або вимикати нейрони можна, просто направивши на них промінь світла, причому прямо в мозку. Метод, що «висвітлив» в останні роки вивчення мозку, називають оптогенетикою.
В очікуванні нового методу
Роботу будь-якої системи зручно вивчати, по черзі вимикаючи окремі її частини. У такий спосіб можна виявити ті з них, що є важливими для роботи всієї системи. Визначивши ключові елементи системи, корисно навчитися ними маніпулювати, тоді ми зможемо керувати процесом на власний розсуд і вивчати його в деталях. Однак, коли йдеться про дослідження нервової системи, застосування такого підходу стикається з серйозними труднощами.
У мозку людини знаходиться близько 80 мільярдів нейронів, що утворюють складні розгалужені сітки. Вважається, кожна окрема нейронна мережу може визначати якусь елементарну функцію. Взаємодія цих мереж у різних зонах мозку забезпечує складну нервову діяльність. Довгі роки про функції структур мозку судили з порушень, які виникали при пошкодженні його ділянок, або з того, які зони мозку активні при виконанні випробуваних різних завдань.
Цікаві результати були отримані в експериментах на тваринах, у мозок яких вживлювали електроди, щоб штучно збуджувати ті чи інші ділянки мозку. На тваринах проводили і дослідження з використанням хімічних речовин,здатних вибірково гальмувати роботу нейронів певного типу Однак кожен з цих методів має суттєві недоліки: або дія одночасно на велику кількість нейронів, або низька тимчасова роздільна здатність. Навіть найменший вживлений в мозок електрод невибірково збуджує всі нервові клітини, що його оточують, а найсучасніший хімічний інгібітор діє набагато довше, ніж природні стимули.
Ідею керувати нейронами «точково» вперше чітко висловив у 1979 році Френсіс Крик (який отримав Нобелівську премію за відкриття структури ДНК). Через двадцять років, 1999-го, він запропонував використовувати для збудження нейронів світло. Світлове випромінювання має багато переваг: воно швидко досягає об'єкта, його легко дозувати та представляти у вигляді коротких імпульсів. У 2005 році група дослідників зі Стенфордського університету під керівництвом Карла Дісерота зуміла викликати збудження нервових клітин, опромінюючи їх світлом. Для цього нейрони довелося зазнати генно-інженерних маніпуляцій. Новий метод отримав назву оптогенетики та за останні роки справив справжню революцію у дослідженнях нервової системи.
Щоб нейрон став світлочутливим, він повинен мати білок – рецептор світла. Приклад нейронів, чутливих до світла від природи, - клітини сітківки ока. Вони містять рецептор родопсин, який складається з білка, званого опсином, і кофактора ретиналю - похідного вітаміну А. Під дією світла ретиналь змінює свою структуру, і ці зміни передаються на білок, який активує сигнальні шляхи нейрона, що викликають його збудження. У спокої нейрон заряджений негативно: усередині клітини концентрація натрію та інших позитивних іонів мала. При збудженні включаються іонні канали у зовнішній мембрані нейрона, що закачуютьпозитивний натрій усередину. Заряд усередині клітини стає позитивним. У такому стані нейрон збуджений і готовий передати сигнал іншим нейронам у мережі.
Перші спроби створити нейрони, керовані світлом, полягали у перенесенні у яких опсинових генів ссавців. Читання нового гена у таких нейронах призводить до синтезу світлочутливого білка. Ці роботи, які проводилися на початку 2000-х, мали дуже обмежений успіх. Під впливом світла штучні нейрони з родопсином активувалися повільно і нестабільно. Сигнальні системи нейронів не призначені для взаємодії із родопсином. Здавалося, оптогенетика, тільки-но виникши, зайшла в глухий кут. Рішення прийшло несподівано.
Не лише тваринам потрібно відчувати світло. Світлочутливі рецептори мають, наприклад, одноклітинні водорості. Їхній «зір» також заснований на роботі родопсинів. Чудова властивість цих білків полягає в тому, що вони не тільки сприймають світло, але й відіграють роль іонних каналів і викликають збудження клітини. Тому їх заведено називати канальними родопсинами. Виявилося, що ці білки працюють набагато стабільніше родопсинів ссавців. Нейрони, що несуть їх на своїй поверхні, дають швидку та чітку відповідь на світлове випромінювання. Перший канальний родопсин відкрили американці Д. Остерхельт і В. Стокеніус у 1971 році, але минуло понад 30 років, перш ніж родопсини мікроорганізмів та нейрони ссавців «зустрілися». У ході досліджень родопсинів мікробів відкрили цілу низку світлочутливих білків з різними властивостями. Одні з них проводять іони натрію, інші відразу кілька типів позитивних іонів. Є родопсини, що навпаки виводять позитивні іони з клітин. Вони здатні знімати збудження. Отже, можна як цілеспрямовано активувати, а йвимикати нейрони. На особливу увагу заслуговують родопсини, що сприймають світло з різною довжиною хвилі. Це дозволяє одночасно і незалежно керувати різними групами нейронів за допомогою, наприклад, синього та червоного світла.
У 2002 році біологи з Франкфурта описали новий родопсин одноклітинної зеленої водорості Chlamydomonas reinhardtii. Цей білок став першим канальним родопсином, використаним для керування нейронами. Спочатку обнадійливі результати були отримані на культурах клітин. Наступний крок - управління нейронами в мозку живого організму - став можливим завдяки розвитку генно-інженерних методів. У 2005 році, невдовзі після експериментів із культурами клітин, група під керівництвом Хірому Яво з Університету Тохоку в Японії провела експеримент із мозком живої миші.
Другий спосіб доставки гена в клітини працює набагато швидше. У ньому використовуються віруси, що несуть ген родопсину. У разі введення в мозок досить великої кількості вірусу, що проникає в нейрони, напрацювання світлочутливих білків відбувається дуже ефективно. Генно-інженерні віруси, що використовуються для цих цілей, сильно змінені та не здатні розмножуватися. Вони ефективно проникають у клітини та напрацьовують у них родопсин, в іншому для організму експериментальної тварини вони нешкідливі.
Окреме завдання - доставка світла до нейронів, які розташовані в глибині мозку. Найчастіше для цього використовуються оптоволоконні світловоди. Джерелом світла може бути лазер чи світлодіод. Конструкція пристроїв дозволяє гризуну вільно переміщатися в клітці, незважаючи на кабель, що постійно підключений до голови. З недавньою розробкою родопсину, що активується червоним світлом, завдання висвітлення мозку спростилося. Червоне світло добре проникає в тканини і в ряді завдань при йогоВикористання вдасться відійти від впровадження в мозок оптоволокна.
Завдяки оптогенетиці безліч питань щодо роботи мозку отримали шанс на вирішення. Так, наприклад, високоточна прицільна активація або високоточне прицільне вимкнення зон мозку дозволили картувати області, відповідальні за довготривалу та короткочасну пам'ять. З іншого боку, з'явилася можливість підійти до вивчення пам'яті з нового боку.
Наше сприйняття навколишнього представлено в мозку поєднанням активних та недіючих нейронів. Спогади — це відтворення комбінації збуджених нейронів, яка колись виникла. В одній з недавніх робіт, виконаних у Массачусетському технологічному інституті під керівництвом нобелівського лауреата Судзумі Тонегави, миші за допомогою світла викликали спогади і надавали їм нового сенсу. Це дослідження ґрунтується на класичному підході до вивчення пам'яті з використанням миші як модельний об'єкт. У центрі уваги знаходиться реакція страху на електричний шок, що виникає в кімнаті, де тварина колись відчувала.
Уявімо мишу в кімнаті А, тут вона поводиться зазвичай. Перенесемо гризуна в кімнату Б з іншим оточенням і зазнаємо слабкого електричного шоку. Тепер при кожному перенесенні в кімнату Б миша відчуватиме страх навіть без шоку. Оцінити страх у разі досить просто: зазвичай дуже рухливий гризун групується і завмирає. Згадка про кімнату Б асоціюється у тварини з болючим відчуттям. Нейробіологам вдалося зробити світлочутливими лише ті нейрони, які активувалися під час знаходження миші в кімнаті А. Комбінація світлочутливих нейронів у даному випадку – записаний спогад про цю кімнату. Далі експериментатори викликали цей спогад іздопомогою світла під час електричного шоку в кімнаті Б. Чи стала миша після цього боятися удару в кімнаті А де ніколи раніше його не відчувала? Правильна відповідь: так.
Краса цієї роботи заснована на більш ранніх дослідженнях мозку, які виявили в ньому ділянку, пов'язану зі спогадами. Це гіпокамп. Саме з його нейронами проводилися маніпуляції у згаданому експерименті.
Повернення до сітківки
Отже, родопсин мікробів визнали вдалим інструментом для створення світлочутливих клітин. Але чи можна застосувати мікробні родопсини для лікування сліпоти? Існує спадкове захворювання – пігментний ретиніт, пов'язане з дегенерацією клітин сітківки ока. Воно викликає прогресуючу втрату зору. Ефективного лікування пігментного ретиніту сьогодні немає. Значна частина випадків цієї хвороби пов'язана з порушеннями в гені, що кодує родопсин. Цей ген важливий до роботи двох типів клітин-рецепторів у складі сітківки. Це палички, що мають гарну світлочутливість, але не здатні забезпечувати кольоровий зір, і колбочки, що дозволяють розрізняти колір, але менш чутливі до інтенсивності світла. У хворих на пігментний ретиніт клітини палички досить швидко гинуть, проте колбочки, втративши здатність сприймати світло, живуть ще довгий час. Чи є можливість замінити в клітинах, що залишилися, непрацюючий родопсин на світлочутливий білок з бактерій? Група дослідників зі Швейцарії під керівництвом Ботонда Роска для відповіді це питання використовувала канальний родопсин архебактерій.
Існує мишача модель пігментного ретиніту. Якщо за допомогою вірусів внести мікробний родопсин у колби сітківки, у гризунів спостерігається часткове відновлення зору. У стандартних тестах такі миші демонструвалиполіпшення орієнтації у просторі проти хворими гризунами без терапії. Цікаво, що використаний у роботі мікробний білок, званий eNpHR 3.0 (удосконалений галородопсин з Natronomonas pharaonis версії 3.0), є вже третьою версією модифікованої вихідної молекули. Методами генетичної інженерії постійно ведеться удосконалення мікробних родопсинів для поліпшення їхньої роботи в клітинах ссавців.
Не тільки нейрони
Можливість керувати майже будь-якими групами нейронів у мозку породила нові експериментальні роботи, багато з яких стали справжнім проривом у своїй галузі. Але сьогодні додаток оптогенетики – це не лише нейрони. Строго кажучи, до оптогенетики можна віднести будь-який метод, що передбачає активацію будь-якого процесу світлом, якщо така активація забезпечена методами генної інженерії.
На даний момент створено системи, в яких світло може керувати активністю гена, вимикати роботу білків або запускати клітинну загибель. Примітно, що у таких дослідженнях використовуються як білки, діючі як іонні канали. Так, наприклад, отримано білок, названий KillerRed (червоний кілер), що виробляє при опроміненні світлом активні форми кисню. Активний кисень здатний руйнувати будь-які органічні молекули. Опромінення червоним світлом клітини з досить великою кількістю білка KillerRed викликає її загибель. Втім, подібний метод можна використовувати не лише для вбивства цілої клітини. За допомогою генетичних методів ділянку, що генерує активні форми кисню в невеликих кількостях, можна включити до будь-якого клітинного білока. Тоді світло викличе інактивацію всіх таких білків у клітині, що дозволить судити про їх функцію. Перспективною також може бути цілеспрямована доставкасвітлочутливих молекул у клітини ракових пухлин для їх знищення.
Ідея керування клітинами за допомогою світла народилася задовго до появи оптогенетики. Проте її реалізації потрібно розвиток низки галузей науки, особливо генної інженерії. Цікаво спостерігати, як із незв'язаних робіт з вивчення світлочутливих білків мікробів та мозку ссавців виник метод, визнаний науковою спільнотою революційним. Об'єднавши кілька наукових галузей, оптогенетика сьогодні сама стала двигуном технологій, які розробляють під її запити.