Додаткові матеріали з лабораторної діагностики ентеровірусної інфекції
Кишкові віруси (ентеровіруси) людини входять до роду Enterovirus сімейства Picornaviridae. До них відносяться віруси поліомієліту (3 серотипи), Коксакі А (24 серотипи), Коксакі В (6 серотипів), ECHO (34 серотипи) та ентеровіруси людини 69-72 серотипів. Ентеровірус 70 викликає гострий геморагічний кон'юнктивіт, ентеровірус 72 - вірус гепатиту А. У рід Enterovirus входять також кишкові віруси тварин (великої рогатої худоби, мавп, свиней, мишей) та комах. Ентеровірус тварин характеризуються видовою специфічністю.
Зверніть увагу: Коксакі А 23 ідентичний ЕСНО 9. ЕСНО 28 віднесено до риновірусів, ЕСНО 34 - варіант Коксакі А 24
Ентеровіруси викликають у людини ураження центральної нервової системи (енцефаліт, менінгоенцефаліт, поліомієліт, менінгіт), шлунка та кишок (діарея, гепатит, панкреатит), а також дихальних шляхів (риніт, фарингіт, пневмонія новонароджених та ін.), серцево-сос. міокардит, перикардит). Можливий також розвиток герпетичної ангіни, екзантеми, везикулярного стоматиту, міалгії та кон'юнктивіту. Різні ентеровіруси можуть зумовлювати однакові клінічні прояви, водночас один ентеровірус здатний призвести до розвитку різних клінічних синдромів.
Матеріалом для дослідження служать фекалії, змив з носової частини глотки, спинномозкова рідина, кров, сироватка, вміст везикул, сеча, асцитична рідина. Від трупа беруть на дослідження кров, спинномозкову рідину, тканину спинного та довгастого мозку, варолієвого мосту, шматочки кишок та їх вміст, шматочки печінки, селезінки, легені, підшлункової залози, міокарда, лімфатичні вузли. Матеріал беруть у перші години хвороби, від трупа — пізніше як за 3—4 год після смерті.
Кров (близько 10 мл) длявірусологічного аналізу та приготування сироватки беруть натще на початку хвороби, а потім через 3-4 тижні.
Фекалії (4-6 г) збирають з інтервалом 1-2 дні (можна використовувати флакони з-під антибіотиків). Готують 10% суспензію в розчині Хенкса, струшують і освітлюють центрифугуванням протягом 30 хв при 3000 об/хв (при можливості центрифугують матеріал при 10 000 об/хв). Надосадову рідину обробляють ефіром (до освітленої суспензії фекалій додають 50% за обсягом діетилового ефіру, суміш залишають у холодильнику під ватно-марлевою пробкою протягом 12-16 годин) та антибіотиками.
Ректальні тампони поміщають у пробірку з 1-2 мл розчину Хенкса або Ерла, споліскують, віджимають. Матеріал центрифугують та обробляють ефіром та антибіотиками.
Глотковий змив в об'ємі 20 мл одержують при 2-кратному (з інтервалом 3 хв) полосканні горла стерильним сольовим розчином або дистильованою водою. Тампонами протирають задню стінку глотки, мигдалики та піднебінні дужки і занурюють у пробірку з 1-2 мл розчину Хенкса. Матеріал центрифугують та обробляють ефіром та антибіотиками.
Стерильну прозору спинномозкову рідину (близько 3 мл) використовують для виділення вірусу без попередньої обробки. Мутну спинномозкову рідину, а також містить еритроцити центрифугують. Сечу в обсязі 10 мл беруть у стерильний посуд у середині акту сечовипускання та обробляють антибіотиками.
Проби секційного матеріалу розтирають у стерильній ступці, готують 20% суспензію в розчині Хенкса, центрифугують 5-10 хв при 2000 об/хв.
Матеріал обробляють антибіотиками — пеніциліном (1000 ОД/мл) та стрептоміцином (500 ОД/мл) протягом 2 годин при кімнатній температурі, а потім використовують для виділення вірусу. Частину матеріалу заморожуютьта зберігають при температурі -70 °С. Багаторазове заморожування та розморожування неприпустимо, оскільки призводить до інактивації вірусу.
Експрес-діагностика не знайшла широкого застосування при ентеровірусних інфекціях через особливості їх патогенезу. Описано застосуванняРИФдля дослідження клітин спинномозкової рідини. При ротавірусних інфекціях застосовуютьЕМтаІЕМ(див. с. 243).
Виділення вірусу проводять у культурах клітин та на одноденних білих мишах (табл.).
Таблиця. Методи виділення та ідентифікації ентеровірусів
Поліовіруси (1-3-й), більшість вірусів Коксакі В, ECHO, деякі типи вірусів Коксакі А (7-й, 9-й, 14-й, 16-й, 21-й) при розмноженні в культурі клітин нирок мавп надають ЦПД. У культурі клітин нирок ембріона людини, амніону людини, диплоїдних клітинах WI-38 репродукуються віруси Коксакі А (11-й, 13-й, 15-й, 18-й, 20-й, 21-й, 24-й), ECHO (21-й, 34-й). Більшість серотипів Коксакі А розмножуються та викликають ЦПД у культурі клітин RD (культура з рабдоміосаркоми людини). Для виділення вірусів Коксакі паралельно із культурами клітин заражають новонароджених мишей.
Віруси Коксакі А з матеріалу від хворих найбільш успішно вдається виділити тільки на одноденних мишах-сосунка, так як вони не розмножуються в більшості культур клітин мавп та людини.
Мишей-сосунд заражають в мозок (0,01 мл), підшкірно (0,03 мл), внутрішньочеревно (0,05 мл) або комбінованим методом. За інокульованими тваринами спостерігають 14 днів. При розвитку клінічних симптомів із мозку хворих тварин та тушок готують 20% суспензію для подальшого пасування вірусу. Беруть також шматочки тканин для гістологічного дослідження.
Індикацію ентеровірусів проводять за ЦПД та бляшкоутворенняпід агаровим або бентонітовим покриттями, у культурі клітин, розвитку паралічів у мишей-сосунь та їх загибелі, а також за фізико-хімічними властивостями: невеликі розміри, резистентність до жиророзчинників та низьким значенням рН (3,0), термостабільність при температурі 50 °С у присутності 1 М MgCl2 (магнію хлориду).
Для ідентифікації ентеровірусів застосовують РН, РТГА, РСК, РПГ, РІФ із типоспецифічними імунними сироватками.
РНпроводять у культурі клітин або мишах-сосунках за загальноприйнятою методикою.
Ідентифікацію штамів вірусів Коксакі А. В і ECHO, що володіють гемагглютинуючими властивостями, здійснюють за допомогоюРТГАз використанням антигенів із заражених клітинних культур та 1 % суспензії еритроцитів людини групи 0(І).
ДляРСКзамість антисироваток застосовують імунну асцитичну рідину мишей, що має меншу антикомплементарність.
РПГдає хороші результати з антигеном, концентрованим у 200-400 разів.
Для концентрації ентеровірусів застосовується бентонітовий метод. До 500 мл культуральної виукраїнсодержащей рідини додають 0,05-0,1% гелю бентоніту за сухою вагою сорбенту, рН суміші доводять до 3,5-4,0 0,1 N розчином НС1. Суміш струшують 3-5 хв, центрифугують при 2000-3000 об/хв протягом 10-15 хв. Осад (вірус-бентоніт) відмивають 20-40 мл дистильованої води. Елюцію вірусу здійснюють 0,05 М розчином трис-буфера (рН 9,0) при інтенсивному струшуванні протягом 4-5 хв. Після цього суміш центрифугують та досліджують надосадову рідину, в якій знаходиться вірус. Цей метод дозволяє сконцентрувати вірус у 100-200 разів.
Для серологічної діагностики застосовують РН, РЗК, РТГА. Діагностичне значення має 4-кратне та більше збільшення титру антитіл.Результати серологічного дослідження необхідно зіставити з вірусологічними, епідеміологічними та клінічними даними.
Для проведення РН змішують 100 доз вірусу з 2-кратними розведеними сироватками хворого. При проведенніРНу культурах клітин результати враховують на 3-4-й та 7-8-й день, на мишах-сосунках - на 10-14-й день.
РСКвикористовують для діагностики поліомієліту. Діагностичне значення має виявлення антитіл у титрі 1: 32 і вище, а також збільшення титру антитіл у 4 рази та більше. Найкращі результати дають непрогріті (малореактивні) антигени, отримані шляхом одноразового заморожування та відтавання інфікованих клітин після настання повної специфічної деструкції.
РТГАдля серологічної діагностики ентеровірусних інфекцій застосовується рідко. Гемагглютинуючий антиген отримують при високому титрі вірусу (10 6 - 10 7 ЦПД50/МЛ). Сироватки хворих обробляють для видалення спонтанних гемагглютинінів та неспецифічних інгібіторів гемаглютинації.