Лабораторна діагностика хламідійної інфекції
…за різними даними, від 5 до 15 % молодих сексуально активних людей уражені хламідійною інфекцією.
ВСТУП
Хламідії (Chlamydia) - дрібні грамнегативні кокоподібні бактерії розміром 250-1500 нм (0,25-1 мкм). Вони мають усі основні ознаки бактерій: містять два типи нуклеїнових кислот (ДНК та РНК), рибосоми, мурамову кислоту (компонент клітинної стінки грамнегативних бактерій), розмножуються бінарним поділом та чутливі до деяких антибіотиків.Сімейство Chlamydiaceae(що входить упорядок Chlamydiales) є облігатними внутрішньоклітинними бактеріями, які мають дві форми життя (елементарні та ретикулярні тільця), подібний двофазний цикл розвитку (що складається з чергування різних форм - елементарного тільця) і ретикулярного тільця), мають схильність до персистенції (або до латентного (прихованого) існування).
Згідно з новою міжнародною класифікацією є чотири сімейства і 5 пологів хламідій. У кожному роді представлено від одного до шести видів, що відрізняються між собою за низкою фенотипічних ознак. Кожен вид має не тільки своє місце в класифікації, але також має свої патогенні потенції, що потребують особливого терапевтичного підходу.
Розглянемо найбільш значущі (патогенні) для людини види хламідій (не занурюючись у цю тонку та складну класифікацію). (1)Chlamydia psittaci: викликає у людини атипову пневмонію, енцефаломіокардит, артрит, пієлонефрит, енцефаломіокардит (ця хламідія є абсолютним зоонозом, тобто, інфекція передається людині від тваринного шляху передачі; ). (2)Chlamydia pneumonia(абсолютний антропоноз - передається людині виключно від хворого або інфікованого)людини, зараження людини відбувається повітряно-краплинним шляхом та повітряно-пиловим шляхом): викликає у дорослих гострі респіраторні захворювання, зокрема бронхіти та м'яку форму пневмонії, що мають тенденцію до хронізації процесу. (3)Chlamydia trachomatis(у ній виявлено 18 антигенних серотипів): зустрічається тільки у людини і викликає найширший спектр хвороб, включаючи урогенітальні захворювання, кон'юнктивіти, деякі форми артритів (серотипи хламідій, що викликають ураження урогенітального тракту передаються до людини при статевому контакті).
Особливістю хламідій є те, що вони розвиваються тільки в епітелії особливого типу, в так званому призматичному (циліндричному) епітелії, тому уражаються органи, покриті цим епітелієм. Chlamydia pneumonia та Chlamydia psittaci, вражаючи епітелій дихальних шляхів, насамперед бронхів, викликають хронічні, рідше гострі, бронхіти та пневмонії («запалення легень»). Chlamydia trachomatis ж, ушкоджуючи слизову оболонку уретри, каналу шийки матки, маткових труб призводить не тільки до гострих запальних процесів, але й до хронізації з наступними ускладненнями, найгрізнішим з яких є безпліддя
Численні клініко-епідеміологічні дослідження свідчать про широке поширення хламідійної інфекції. Сьогодні хламідійна інфекція міцно посіла друге місце після пневмокока в спектрі збудників пневмоній, які нерідко мають тенденцію до хронізації та тяжкого перебігу з летальними наслідками. 50–80% випадків порушення репродуктивної функції у жінок обумовлені інфекційними ураженнями, серед яких хламідійні зустрічаються найчастіше.
Клінічну діагностику хламідіозу ускладнюють тривалий безсимптомний перебіг, нехарактерніклінічні прояви, неефективність імунохімічних та серологічних методів аналізу, дорожнеча, тривалість та трудомісткість мікробіологічного методу.
ТЕХНІКА ВЗЯТТЯ МАТЕРІАЛУ
Перш ніж розглядати методи лабораторної діагностики хламідійної інфекції, необхідно розглянути техніку взяття матеріалу, оскільки дана процедура входить один із найвідповідальніших етапів діагностики хламідіозу – етап забору матеріалу.
При дослідженні на хламідії методом зараження культури клітин перед взяттям матеріалу хворі не повинні приймати протягом місяця антибіотики тетрациклінового ряду; при цитологічній методиці, у тому числі і при використанні моноклональних флюоресціюючих антитіл, антибіотики не слід застосовувати за два тижні до дослідження. Перед взяттям матеріалу з уретри хворі повинні мочитися протягом 1-1,5 години.
При взятті матеріалу на хламідії слід пам'ятати, що оптимальним для присутності та розмноження хламідій є певні ділянки циліндричного епітелію сечостатевих шляхів (передня уретра на глибині 2,5-4 cм у чоловіків, слизова оболонка цервікального каналу матки на глибині 1 5 см у жінок). При взятті матеріалу із шийки матки ключовим моментом є видалення слизової пробки. Від ретельності проведення цієї підготовчої процедури залежить правильність зіскрібка клітин цервікального каналу. Слизову пробку видаляють ватним тампоном і пінцетом, а потім беруть матеріал спеціальною щіточкою cervex brush або voba-brush, що має ряд переваг, так як для отримання репрезентативного результату важлива присутність у зразку клітин з усієї поверхні цервікального каналу, зони трансформації. Досить інформативним є дослідження у чоловіків осаду першої порції ранковоїсечі методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).
Забір матеріалу у дівчаток проводиться зі слизової оболонки присінка піхви, в окремих випадках - із заднього склепіння піхви через гіменальні кільця. Об'єктом дослідження на наявність хламідій можуть бути змив зі слизової оболонки очей, носоглотки, мокротиння, бронхоальвеолярний змив.
ЛАБОРАТОРНІ МЕТОДИ ДІАГНОСТИКИ
Цитоскопічні методи. При цитоскопічному методі одночасно з пошуком цитоплазматичних клітин-включень Гальбершедтера-Провачека враховується кількість лейкоцитів як показника запалення, а також додаткова інформація про наявність супутньої бактеріальної мікрофлори, дріжджоподібних грибів, трихомонад тощо. Цитоскопічний метод широко доступний, але ефективний лише при гострих формах інфекції, значно менш ефективний та інформативний при хронічних формах захворювання.
Імуноморфологічні методи. Ці методи ґрунтуються на виявленні антигенних субстанцій хламідій в епітелії та інших тканинах шляхом обробки препаратів антитілами. Антитіла діагностичної антихламідійної сироватки з'єднані з якоюсь міткою - люмінесцентною (ФІТЦ-антитіла) або ферментною (ензим-мічені антитіла).
Пряма імунофлюоресценція (ПІФ). Цей метод передбачає пряме виявлення антигенів хламідій. При люмінесцентній мікроскопії хламідійні включення визначаються у вигляді утворень у клітині епітелію із зеленою або жовто-зеленою флюоресценцією на коричнево-жовтогарячому фоні цитоплазми клітин. Включення можуть мати зернисту, гомогенну або змішану структуру. Діагностична інформативність ПІФ пов'язана з тим, що з її допомогою виявляються не тільки корпускулярні, але й антигени розчинні хламідій.
Непрямий метод імунофлюоресценції.Непрямий метод імунофлюоресценції застосовують у тих випадках, коли немає в наявності ФІТЦ-кон'югату антихламідійних антитіл. У цих випадках приготовлений тим же методом, що і для ПІФ препарат з клінічних проб спочатку обробляють антихламідійними антитілами, отриманими шляхом імунізації хламідіями овець, кроликів, мишей або інших тварин, а потім другою сироваткою, специфічною для виду тварини, яка була імунізована хламідіями. Антитіла другої сироватки кон'юговані з ФІТЦ.
Методи імуноферментного аналізу. Ці методи засновані на виявленні розчинного хламідій антигену в досліджуваних пробах. Найчастіше в клінічній практиці застосовуються набори реагентів, що ґрунтуються на методі твердофазного ІФА-аналізу для визначення антигенів хламідій. Тверда фаза покрита моноклональними хламідійними антитілами встановленої специфічності. Ампліфікація досягається з використанням технології полімерної кон'югації, в результаті чого відбувається фіксація, при якій на кожну пов'язану ділянку антигену припадає полімерний комплекс із високомолекулярним фрагментом. Крім того, ампліфікація виконується на стадії означеного відтворення з використанням запатентованої технології фермент-ампліфікації. Візуально позитивні проби забарвлюються в жовто-жовтогарячий колір. Інтенсивність забарвлення пропорційна кількості антигену хламідії. Точний результат дослідження визначають за допомогою спеціальних апаратів для ІФА.
Виділення хламідій у культурі клітин МсСоу. Одним з кращих, але водночас найбільш трудомістким є метод діагностики хламідій шляхом виділення збудника в культурі клітин, оброблених різними антиметаболітами («золотий стандарт»). Для цієї мети зазвичай використовують чутливу культуру клітин, обробленуциклогексімідом. Чутливість культурального методу проти ПЛР становить 70-80%, але водночас він перевищує молекулярно-биологические методи діагностики за специфічністю.
Культуральний метод є референс-методом в оцінці ефективності антибактеріального лікування. При дослідженні біопроб методом ПЛР після курсу хіміотерапії в деяких випадках можна отримати «хибнопозитивні з клінічної точки зору» результати. Це з тим, що неможливо однозначно оцінити життєздатність і патогенність мікробної клітини виходячи з виявлення фрагмента її геному, використовуючи лише дані молекулярно-биологических методів. У цьому випадку при дослідженні клінічного матеріалу за допомогою культурального посіву мікробні клітини, що втратили ці важливі з клінічної точки зору властивості, не дадуть зростання клітинної культури.
Діагностика методом полімеразою ланцюгової реакції (ПЛР). Екстремально високі показники чутливості та специфічності ПЛР роблять цю методику багато в чому революційною в лабораторній діагностиці, але, незважаючи на це, особливу увагу при його використанні слід приділяти, без сумніву, питанням правильної інтерпретації результатів. Основними мішенями для виявлення хламідії трахоматис методом ПЛР є нуклеотидна послідовність видоспецифічної криптичної плазміди, послідовність геному головного білка внутрішньої мембрани, рибосомальні гени.
Порівняно з широко застосовуваними імунологічними тестами ПЛР-діагностика має ряд переваг:(1) висока та регульована специфічність, обумовлена лише нуклеотидною послідовністю, що застосовується в даній діагностичній системі; (2) висока чутливість, що дозволяє діагностувати не тільки гострі, але й латентніінфекції (можливе виявлення навіть поодиноких бактерій чи вірусів); (3) хімічна схожість усіх нуклеїнових кислот, що дозволяють розробляти універсальні процедури для виявлення різних інфекційних агентів; (4) можливість ідентифікації збудника протягом 4,5-5 годин.
Зверніть увагу. В даний час не існує лабораторного методу, що дозволяє уникнути як хибнопозитивних, так і хибнонегативних результатів. При діагностиці хламідіозу необхідна комплексна лабораторна діагностика (ПІФ, ІФА, культуральний метод, ПЛР, виявлення титрів антитіл до антигенів збудника), що дозволяє виявити збудника, визначити стадію захворювання, обґрунтувати необхідність призначення антибактеріальних препаратів. Вивчення імунного статусу та обґрунтоване застосування імуномодуляторів дозволить підвищити ефективність лікування у віддалені після зараження терміни.