Основні ферменти, що використовуються в генній інженерії
Рестриктази та ДНК-метилази
Серед ферментів, що використовуються в генній інженерії для клонування, велике значення мають ендонуклеази рестрикції -рестриктази. Ці ферменти, вперше відкриті як частина системи рестрикції-модифікації ДНК у бактерій, специфічно гідролізують молекули дволанцюжкових ДНК за наявності в них певних послідовностей нуклеотидів, званих сайтами рестрикції. У той же час метилази використовують для обмеження кількості сайтів рестрикції та отримання більших фрагментів ДНК за допомогою рестриктаз.
Класифікація рестриктаз.За механізмом дії та молекулярною структурою розрізняють три типи рестриктаз. Ферменти рестрикції типу I являють собою складні мультимірні комплекси, побудовані з трьох субодиниць з молекулярною масою до 300 кДа, які володіють рестриктазною, ДНК-метилазною та атразною активностями. Рестриктази типу I для прояву своєї активності вимагають присутності ATP, S-аденозилметіоніну та іонів Mg 2+ , вони не розпізнають специфічні послідовності нуклеотидів і через це не знаходять широкого застосування генної інженерії. Рестриктази типу II дізнаються специфічні послідовності нуклеотидів у точці розщеплення ДНК або безпосередньої близькості від неї, вимагають прояву активності наявності в реакційної суміші ATP та іонів Mg 2+ і найчастіше використовуються при молекулярному клонуванні. Ферменти типу III також активні лише в присутності ATP та іонів Mg 2+ і не виявляють абсолютної залежності від S-аденозилметіоніну.
Мал. ІІ.1. Форми розривів дволанцюжкових ДНК, що утворюються під дією рестриктаз
а– 5'-виступаючі (1), 3'-виступаючі "липкі" (2) і "тупі" (3) кінці ДНК, що утворюються під дією рестриктазBamHI,KpnI іPvuII відповідно. Стрілки позначені місцями розривів ланцюгів ДНК, пунктирною лінією – вісь симетрії сайтів рестрикції;
б- лігування з втратою сайту рестрикції
Назви рестриктаз складаються з перших літер видових назв бактерій, у яких вони виявлені, наприклад,Eco– E. coli. У тому випадку, коли різні за специфічністю дії рестриктази присутні в клітинах різних штамів одного виду бактерій, в назву рестриктази вводять додаткову літеру, наприклад рестриктазиHincіHindвиділені з бактеріальних клітин Haemophilus influenzae, штами з і d. Цифри, що йдуть за буквеними позначеннями, відображають послідовність відкриття відповідних рестриктаз у клітинах бактерій одного виду, наприкладHaeI,HaeII іHaeIII з H. aegipticus.
Рестриктази типу ІІ – основний інструмент генної інженерії. Більшість рестриктаз типу II специфічно впізнають на ДНК тетра-і гексануклеотидні послідовності, а принаймні три з них – октануклеотиди. Чим коротше олігонуклеотидна послідовність сайту рестрикції, пізнаваного рестриктазою, тим частіше він зустрічається у випадковій послідовності нуклеотидів, в якій кожен із чотирьох нуклеотидів представлений з однаковою частотою (50% А-Т-пар та 50% G-С-пар). Так, випадкова тетрануклеотидна послідовність зустрічається в середньому через кожні 256 п.о. (4 4), а гексануклеотидна – через кожні 4096 п.о. (4 6). Однак у природних ДНК розподіл нуклеотидів може помітно відрізнятися від випадкового. Наприклад, для еукаріотичних ДНК характерна низька частота народження динуклеотиду CpG і відповідно сайтів рестрикції, що містять ці динуклеотиди (рестриктазиHhaI,HpaII,TaqI,ThaI,AvaI,HaeII,HindII, SalI,SmaI,XhoI,XmaI). Істотне відхилення частоти народження сайтів рестрикції від очікуваного при випадковому їх розподілі вздовж ДНК властиво і хромосомам термофільних бактерій, яким, навпаки, властиво (хоча і не у всіх випадках) збагачення по G-С-парах. Більшість сайтів, відомих рестриктазами типу II, характерно наявність у яких симетрії другого порядку, тобто. відомі ними послідовності є паліндроми, наприклад у рестриктазиEcoRI – 5'-GAATTC-3'. Це означає, що нуклеотиди, розташовані в кожному з ланцюгів на рівній відстані від осі симетрії, є комплементарними один одному. Якщо точки розщеплення протилежних ланцюгів ДНК зміщені один щодо одного в сайті рестрикції, то кінці ДНК, що утворюються в результаті рестрикції, містять виступаючі одноланцюгові ділянки. Оскільки такі ділянки комплементарні самі собі та один одному і можуть між собою взаємодіяти, їх часто називають "липкими" кінцями. У "липких" кінцях виступаючим одноланцюжковим ділянкою може бути як 5'-, так і 3'-кінець (рис. II.1,а). Формальною ознакою утворення 5'- або 3'-виступаючих "липких" кінців у сайтах рестрикції є розташування точки розщеплення ланцюгів ДНК у послідовності, що використовується для позначення сайту рестрикції, ліворуч або праворуч від осі симетрії відповідно. У деяких рестриктаз точки розщеплення обох ланцюгів ДНК розташовані безпосередньо один під одним у сайті рестрикції. У цьому випадку після розщеплення ДНК "липких" кінців не утворюється, а виходять так звані "тупі" кінці, в яких немає одноланцюгових ділянок ДНК, що виступають (див. рис. II.1,а). Є одна важлива функціональна різниця між 5'- і 3'-виступаючими"липкими" кінцями - останні неможливо помітити шляхом їхньої добудови ДНК-полімеразою. Цю особливість слід мати на увазі при виборі рестриктазу для отримання рестрикційних фрагментів ДНК, які передбачається використовувати як зонди.
При конструюванні рекомбінантних молекул корисно пам'ятати, що хоча рестриктазиBamHI,BclI,BglII іXhoII дізнаються різні сайти рестрикції , вони утворюють одні й самі " липкі " кінці, GATC. Те ж характерно і для групи рестриктаз SalG I,XhoI іAvaI (NCGA). При лігуванні (див. нижче) фрагментів ДНК, утворених рестриктазами однієї з таких груп, відбувається їх об'єднання, але при цьому вихідні сайти рестрикції губляться, тому що в результаті утворюється нова безперервна послідовність нуклеотидів (див. рис. II.1,). б). Сайти рестрикції для деяких рестриктаз II типу не є симетричними. Наприклад, рестриктазаHgaI дізнається асиметричну послідовність 5'-GACGC-3', а одноланцюгові розриви вносить у протилежні ланцюги ДНК, відступивши праворуч на 5 і 10 нуклеотидів відповідно:
Послідовності нуклеотидів "липких" кінців, що утворюються, є унікальними для кожного такого сайту рестрикції. Внаслідок цього рестрикційні фрагменти ДНК, що утворилися під дією даної рестриктази, у суміші з'єднуються один з одним лише в строго певній вихідній послідовності, яка задається унікальними послідовностями нуклеотидів у "липких" кінцях рестрикційних фрагментів ДНК. Наприклад, при розщепленні цієї рестриктази реплікативної форми ДНК фага fX174 утворюється 14 фрагментів, які in vitro об'єднуються в правильну послідовність з утворенням інфекційної fX174-ДНК.
Універсальні рестриктази для одноланцюгових ДНК. На основі рестриктаз, які впізнають асиметричні послідовності нуклеотидів, розроблена система, що дозволяє розщеплювати молекули одноланцюгової ДНК у будь-якій заданій точці. З цією метою синтезується олігонуклеотид, 5'-кінцева частина якого містить сайт, відомий такою рестриктазою, а послідовність нуклеотидів 3'-кінцевої частини комплементарна ділянці ДНК, в який необхідно внести ендонуклеазний розрив. В результаті гібридизації олігонуклеотиду з одноланцюгової ДНК утворюється структура, зображена на рис. ІІ.2. При цьому фермент взаємодіє з сайтом впізнавання (ділянка I), а розриви вносяться місцями, позначеними стрілками. Таким чином, положення місця ендонуклеазного розщеплення повністю залежатиме від послідовності нуклеотидів ділянки II синтетичного олігонуклеотиду, комплементарного ДНК-субстрату.
Мал. ІІ.2. Розщеплення одноланцюгової ДНК універсальною рестриктазою
а– синтетичний олігонуклеотид;б- одноланцюжкова ДНК.
Після утворення шпильки та гібридизації з одноланцюгової ДНК-мішенню олігонуклеотид утворює сайт зв'язування рестриктази (ділянка I) та сайт розщеплення ДНК-ДНК-гібриду (ділянка II). Стрілки вказують місця ендонуклеазного розщеплення ДНК та олігонуклеотиду.
Изошизомеры. У клітинах різних видів бактерій можуть міститися рестриктази, які впізнають одні й самі сайти рестрикції. Такі рестриктази називаютьізошизомерами. Изошизомеры деяких рестриктаз успішно використовуються виявлення метильованих ділянок ДНК в геномі. Так, рестриктазиHhaI іHpaII розщеплюють неметильовані послідовності GCGC і CCGG відповідно і втрачають здатність до розщеплення, якщо хоча б один із залишків цитозину в цих сайтахметильований. У той же час, ферментMspI (ізошизомерHpaII) розщеплює послідовність CCGG незалежно від того, метильовані або неметильовані залишки цитозину в такому сайті. N-Метилювання залишків аденозину в ДНК можна виявити за допомогою ізошизомерівSau3A (розщеплює як метильовані, так і неметильовані послідовності GATC),DpnI (розщеплює тільки метильовані послідовності G Me ATC) іMboI (розщеплює лише неметильовані послідовності).
Зміна специфічності дії рестриктазу в неоптимальних умовах. Рестриктази є високоспецифічними ферментами. Однак для підтримки цієї специфічності in vitro необхідно дотримуватись у реакційній суміші оптимальних умов для дії ферментів. При порушенні таких умов у деяких рестриктаз починає проявлятись вторинна (так звана штрихова) активність. Так, рестриктазаEcoRI розщеплює послідовність GAATTC при pH 7,3, 100 мМ NaCl у присутності 5 мМ MgСl2, проте при зміні значень pH, зниженні концентрації NaCl або заміні іонів Mg 2+ на Mn 2+ , а також у присутності органічних розчинників у ферменту з'являється тенденція розщеплення більш короткої послідовності AATT (так звана активністьEcoRI). До рестриктазів, що мають подібні властивості, відносяться також BamH I,BstI,BsuI,DdeI,HhaI,PstI,SalI,SstI,XbaI.
Дія рестриктазу на незвичайні субстрати. Крім дволанцюгових ДНК багато рестриктаз здатні використовувати ДНК-РНК-гібриди як субстрат. Це відноситься, зокрема, до рестриктазEcoRI,HindII,SalI,MspI,HhaI,AluI,TaqI іHaeIII. Деякірестриктази, наприкладHaeIII,HhaI іSfaI, здатні розщеплювати одноланцюгову ДНК фага fX174, хоча і зі значно меншою швидкістю, ніж відповідну дволанцюгову RF-форму . Така здатність була продемонстрована для деяких інших рестриктаз, а також ДНК-субстратів. Залишається незрозумілим, чи дізнаються ці рестриктази справжні одноланцюгові сайти або послідовності нуклеотидів, укладені в елементи вторинної структури.
З розвитком методу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) (див. нижче) часто виникає необхідність розщеплення рестриктазами ампліфікованих олигонуклеотидов неподалік їх кінців, тобто. в умовах, коли сайт рестрикції фланкований з одного зі своїх кінців одним або декількома нуклеотидами. У цьому випадку встановлена чітка залежність здатності певних рестриктаз розщеплювати сайти рестрикції від кількості фланкуючих сайт нуклеотидів. Дану властивість рестриктаз пояснюють, зокрема тим, що на кінцях дволанцюжкової молекули ДНК відбувається локальне плавлення подвійної спіралі ДНК з утворенням коротких одноланцюжкових ділянок, що захоплюють сайт впізнавання рестриктазами. Частково уникнути локального плавлення можна зниженням температури реакційної суміші під час проведення рестрикції таких олігонуклеотидів. Оскільки ці дані мають велике значення для практичної генної інженерії, вони сумовані у табл. ІІ.1.