Спосіб отримання препарату біомаси Laetiporus sulphureus MZ-22

Винахід відноситься до біотехнологічної, медичної, фармацевтичної, харчової та косметичної промисловості, а саме до способів одержання біологічно активних речовин, які можуть використовуватись як біологічно активні добавки (БАД).

Недоліками способу є витрати використання джерел денного світла, необхідність виміру оптичної щільності клітин фотоколориметричним методом.

Недоліками способу є його складність загалом, тривалість екстракції білковоорганічних комплексів (3 дні) з рослинної сировини, отримання іонізованої солі селену, а також витрати на застосування високочастотного електромагнітного поля .

Найбільш близьким за технічною сутністю і досягається результатом є винахід, описаний у патенті (UA 2086645 С 12, 1997). Однією з основних форм існування органічного селену у грибних тканинах є селенметіонін (SeMet) [Whanger P.D. Selenoскладаються в рослинах і особняках і їх біологічному значенні / Journal of American College of Nutrition, Vol.21, No. 3, 223-232 (2002)]. При стандартизованих умовах вирощування дріжджових культур близько 85% селену міститься у них у вигляді SeMet [Ip С., Birringer M., Block E., Kotrebai M., Tyson JF, Uden P.C., Lisk DJ. Chemical speciation influences comparative activity of selenium-enriched garlic and yeast in mammary cancer prevention / J Agric Food Chem., 2000 Jun; 48 (6): 2062-70]. Культура пекарських дріжджів Saccharomyces cerevisiae здатна асимілювати до 3 мг/г біомаси Se [Demirci A., Pometto A.L., Сох D.J. Enhanced organicallybound seleniumy production by fed-bBatch fermentation / J. Agric. Food Chem., 1999, 47 (6), pp 2496-2500], причому більше 90% загального Se перебуває у формі SeMet і лише 0,5% - селенцистеїну (SeCys) [Schauzer G.N. Selenomethionine: З огляду на його nutritional significance, metabolism and toxicity / J. Nutr. 2000, 130, 1653-1656]. Така ж картина спостерігається у вищих їстівних грибів - базидіоміцетів, що культивуються.

Недоліком цього способу є необхідність створення умов хемостату для культивування культур дріжджів та незбалансований склад білка дріжджів роду Candida або Saccharomyces cerevisiae.

Загальновизнано, що селен є необхідним для життя мікроелементом. Його біологічна роль організмі дуже значна.Селен забезпечує функціонування захисної глутатіонпероксидазної системи, входячи в активний центр глутатіонпероксидази, що викликає руйнування надлишкових перекисів в організмі; захищає вітамін Е та ліпіди біологічних мембран від аберантного, окисного руйнування, запобігає утворенню надлишкових кількостей вільних радикалів, стимулює реакційну здатність SH-груп ферментів, посилює процеси біологічного окиснення та фосфорилювання, сприяє нормальному харчуванню м'язу та формуванню фізіологічної. Крім того, селен підвищує імунітет та відіграє важливу роль у підтримці нормального стану органів ендокринної системи зорового аналізатора. Тяжкий дефіцит селену зміщує рівновагу в організмі на користь перекисів, що призводить до важких наслідків - масового руйнування клітин крові та тканин - оксидативного стресу. Ось чому селен – найважливіший мікроелемент, від якого залежить стан імунної системи. Як неспіцифічний імуномодулятор селен надаєХороший лікувальний ефект при бронхіальній астмі, атопічних дерматитах. Селен захищає організм від токсичної дії ртуті, кадмію, свинцю, миш'яку, талію і телуру, від нітратів і нітритів, які мають канцерогенну та ембріотоксичну дію. Доведено радіопротекторну дію селену [Савченко М.Ф., Решетник Л.А., Парфьонова О.О., Прокоп'єва О.В., Скальний А.В. Клініко-гігієнічна оцінка забезпеченості селеном населення Іркутської області // Посібник для лікарів та фахівців медико-біологічного профілю. – Іркутськ, 2001. – 26 с.]. Селенодефіцит може призводити до патологій серцево-судинної та імунної систем. З дефіцитом селену пов'язаний патогенез низки вірусних захворювань (СНІД, гепатит, рак, грип).

Недостатність селену в харчуванні є дуже поширеним станом, що тягне за собою різні несприятливі наслідки. Це ставить на порядок денний питання постачання сполуками біодоступного селену досить широких груп населення. У природних умовах селен надходить в організм людини і тварин, головним чином, в органічному вигляді (місцевих амінокислот -селенометіоніну і селеноцистеїну).Селенометіонін - головна органічна форма селену, присутня в злакових, олійних культурах. Він синтезується мікроорганізмами та рослинами, але не синтезується вищими тваринами та людиною. Штучне постачання організму селеном при його харчовому дефіциті може здійснюватися: - у формі неорганічного селену (селеніту або селенату натрію); - у формі органічних сполук селену мікробіального або дріжджового походження.

Неорганічний селен, що надходить в організм у формі селенат- та селеніт-аніонів, швидко відновлюється до селеноводороду. Надлишкові кількості селеноводороду вкрай повільнопіддаються утилізації з утворенням спиртовмісних сполук селену. Лише певна кількість селену, що входить до складу селеноводороду, включається в процес синтезу спеціальних білків, що містять селен, таких якглутатіонпероксидаза. У людини селен входить до складу цих білків виключно як селену, що з амінокислотою цистеїном, тобто. у вигляді селеноцистеїну. При надходженні в організм надлишкових кількостей неорганічного селену, не забезпеченого достатньою кількістю цистеїну, він може накопичуватися в тканинах у формі вільного гідроселеніданіону, який вкрай токсичний. З цієї причини рекомендується приймати тільки органічно зв'язаний селен як кращу форму постачання організму селеном.

Основною перевагою органічного селену перед його неорганічною формою, крім низької токсичності, є його широкі можливості для накопичення та депонування в людському організмі. При споживанні надлишку органічного селену (селенометіоніну та селеноцистеїну) вони легко займають «вільні місця» однойменних амінокислот у звичайних білках. Місткість цього «консервативного депо» селену в організмі дуже велика. З цією обставиною пов'язана низька токсичність селенометіоніну порівняно з селенітом та іншими формами неорганічного селену. Однак нормальне надходження органічно пов'язаного селену з їжею є малоймовірним.

Культурально-морфологічні та мікроскопічні особливості штаму

на агаризованих середовищах утворює колонії з ватоподібним міцелієм; повітряний міцелій високий край колонії бахромчатий (фіг.1); повітряний міцелій жовто-жовтогарячого кольору; колір субстратного міцелію: рожево-жовтогарячий; колір зворотного боку колонії яскраво-жовтогарячого кольору; пігмент, ексудат і т.д. не утворює; призростанні на рідких живильних середовищах утворює пелети та плівку оранжевого кольору, синтезує каротиноїди, кількість яких залежить від складу живильного середовища та умов освітлення.

міцелій складається з довгих дикаріофітних гіф з простим розгалуженням, без утворення пряжок, штам утворює овальні кулясті та грушоподібні бластоконідії, розташовані на гіфах термінально або інтеркалярно (фіг.2).

Середовища для культивування штаму: капустяна з додаванням 1, 2 та 5% молочної сироватки. Капустяне середовище (г/л): 200 г капусти кип'ятять в 1 літрі води 10 хв; віджимають; доводять до 1 літра; розбавляють водою 2 рази і додають у фільтрат 2% глюкози. Сусло неохмелене (г/л): 250-300 г солоду заливають 1 л води, нагрівають до 48-50°З помішують і підтримують цю температуру протягом 30 хв. Потім нагрівають до t=55-58°C; через 30 хв до 62,5-63°С до повного оцукрювання. Середовище віджимають, фільтрують через паперовий фільтр. У фільтраті визначали концентрацію сухих речовин при 20°З сахарометром. Вона має становити 18-20%. До потрібної концентрації розбавляють водою, яка повинна дорівнювати 3- 4%. За потреби для ущільнення додають 2% агару. Стерилізацію капустяного середовища проводять 30 хв при 1 атм. Для сусло-агару стерилізацію проводять за 0,5 атм.

Умови для культивування штаму: об'єм лабораторної установки для культивування – 1 л, об'єм культуральної рідини – 250 мл; рН – 5; аерація - 1 л/хв з подачею повітря у простір над рідиною при надмірному тиску 0.1 атм; частота обертання мішалки – 250 об/хв; концентрація біомаси 5-8 г/л а.с.м.; температура 26-28°С. Максимальна питома швидкість зростання становить µм=0.042±0.005 год-1. Міцелій штаму при глибинному культивуванні без освітлення має жовто-жовтогарячий колір, в умовах освітлення зфотоперіодом 12:12 год колір міцелію оранжево-червоний. При глибинному культивуванні без освітлення кількість каротиноїдів у міцелії становить 74.5, а в умовах освітлення 1787.8 мг% (фіг.3).

Зберігання штаму рекомендується на сусло-агар протягом 6 місяців для збереження 50% життєздатних бластоконідій; для утворення пігменту необхідне природне висвітлення.

Одним з перспективних об'єктів створення харчових добавок та лікарських препаратів на основі вищих грибів та продуктів їх метаболізму, одержання біологічно активних речовин єгриб сірчано-жовтий трутовик Laetiporus sulphurous (Bull.) Murrill. Широке використання міцеліальних базидіоміцетів, у тому числі Laetiporus sulphureus, зумовлене їхньою здатністю сорбувати різні мікроелементи.

Уміцелії Laetiporus sulphureus присутній цілий комплекс фізіологічно активних сполук білкової, вуглеводної, ліпідної природи, каротиноїдів та вітамінів. Носієм біологічної активності міцелію гриба є ліпокаротиноїдний комплекс [Гвоздкова Т.С., Мішин Л.Т., Чорноок Т.В., Пленіна Л.В., Капіч А.М. Глибинний міцелій гриба, що містить ксантофіл Laetiporus sulphurеus - основа біологічно активної добавки // Успіхи медичної мікології. – 2003. Т.З. - С.218-220; Гвоздкова Т.С., Чорноок Т.В., Філімонова Т.В., Рожкова З.А., Осадча О.В., Смирнов Д.А., Щерба В.В., Бабицька В.Г. Оцінка можливості використання базидіальних грибів як джерела біоактивних ліпідних компонентів. // Успіхи медичної мікології. Т.9, 2007. С.151-154; Феофілова Є.П. Каротиноїди грибів: біологічні функції та практичне використання // Прикладна біохімія та мікробіологія. – 1994. – Т.30, вип.2. - С.181-195; Феофілова Є.П., Терешіна В.М., Меморська А.С. Досягнення та проблеми новоїгалузі біотехнології: отримання медичних препаратів на основі біологічно активних речовин міцеліальних грибів // Успіхи медичної мікології. – 2001. Т.1. – С.254-256].

Наявність уміцелії гриба L.sulphureus цілого комплексу біологічно активних ліпофільних сполук: каротиноїдів, полієнових жирних кислот, стероїдних сполук (ергостерин, тритерпенові кислоти), фосфоліпідів та ін., що володіють антиоксидантними властивостями, отримання біологічно активної добавки [Капіч О.М., Гвоздкова Т.С., Квачова З.Б. та ін. Антиоксидантні, радіозахисні та противірусні властивості екстрактів міцелію гриба Laetiporus sulphureus в умовах глибинного культивування // Успіхи медичної мікології. – 2004. – 3. – С.146-148].

На основі штамів L. sulphureus вже розроблена біологічно активна добавка «Летипорин», що являє собою сухий порошкоподібний міцелій червоно-оранжевого кольору, отриманий шляхом глибинного культивування штаму базидіального гриба Laetiporus sulphureus на живильному середовищі з використанням доступного і відносно дешевого. , Щерба В.В., Гвоздкова Т.С. Нові біологічні активні добавки з урахуванням глибинного міцелію базидіальних грибів // Успіхи медичної мікології. – 2006. Т.7. – С. – 178-180].

Біотехнологічневиробництво білка на основі біомаси Laetiporus sulphurеus не вимагає посівних площ, не залежить від кліматичних умов, піддається високому рівню механізації та автоматизації, дозволяє отримувати продукцію стандартної якості [Тихонова О.В., Лур'є Л.М., Єршова Є.Ю., Єфременкова О.В., Дуднік Ю.В. Вивчення глибинної культури Laetiporus sulphureus (Fr) Bond, et Sing // I з'їзд мікологів України. М.: Національна академія мікології,2002. С.257; Єршова Є.Ю., Єфременкова О.В., Камзолкіна О.В., Тихонова О.В., Лур'є Л.М., Дудник Ю.В. Виділення в культуру та вивчення антимікробної активності представників виду Laetiporus sulphurеus // Антибіотики та хіміотерапія. 2003. – 1. С.3-7].

У складі сухого міцелію міститься 22-24% сирогопротеїну. До складу білкових компонентів входять усі незамінні амінокислоти, частку яких припадає 35-40% від суми амінокислот. Зміст нуклеїнових кислот становить від 2,0 до 2,5% (табл. 1 і 2) [Гвоздкова Т.С., Чорноок Т.В., Філімонова Т.В., Рожкова З.А., Осадча О.В. , Смирнов Д.А., Щерба В.В., Бабицька В.Г. Оцінка можливості використання базидіальних грибів як джерела біоактивних ліпідних компонентів. // Успіхи медичної мікології. Т.9., 2007. С.151-154].