Тема 2 Робота з мікроскопом
-ознайомити з пристроєм мікроскопа, рисувального апарату та особливостями роботи з ними
1 Робота з мікроскопом
2 Робота з апаратом для малювання
3 Вимірювання мікроскопічних об'єктів
Методичні рекомендації щодо підготовки до заняття
Правила роботи з оптичним мікроскопом
1.Обертаючи револьвер, поставити малий об'єктив до клацання на відстань 1-1,5 см від предметного столика
2. Дивлячись в окуляр і направляючи увігнуту поверхню дзеркала до світла, встановити рівномірне та досить яскраве освітлення
3.Покласти гістопрепарат на предметний столик покривним склом нагору
4.Обертаючи макрогвинт, знайти зображення та вивчити препарат під малим збільшенням
5.Не піднімаючи малого об'єктиву, обертанням револьвера встановити великий об'єктив
6. Дивлячись в окуляр, дуже обережним обертанням мікрогвинта знайти зображення під великим збільшенням та вивчити препарат у деталях
7.По закінченні роботи, обертаючи револьвер, доставити малий об'єктив і зняти препарат.
2Робота з апаратом для малювання
При проведенні цілого ряду генетичних досліджень (підрахунку числа хромосом вивченні каріотипів, спорогенезу та гаметогенезу та інших роботах) доводиться користуватися рисувальними апаратами РА-2, РА-4, РА-5 та ін. Найбільш сучасним є РА-5.
Всі ці типи рисувальних апаратів мають більш менш подібний пристрій: за допомогою призми (кубика Аббе), що знаходиться у відкидній металевій оправі, зображення, видиме в мікроскоп, через дзеркало проектується на папір. При роботі з апаратами для малювання РА-2 і РА-4, якщо дивитися через призму апарата в окуляр мікроскопа, можна одночасно побачити препарат і аркуш паперу, розташований праворуч відмікроскоп під дзеркалом рисувального апарату. Для кращого налаштування рисувального апарата слід на аркуш паперу покласти олівець і, регулюючи за допомогою світлофільтрів яскравість освітлення препарату та паперу, досягти хорошого зображення об'єкта, відкинутого на папір. Яскравість зображення препарату регулюють за допомогою димчастих світлофільтрів, розташованих на рухомій пластинці рисувального апарату або за допомогою реостата освітлювача. Яскравість освітлення паперу можна регулювати другим набором світлофільтрів, розташованих на барабані апарата для малювання, або видаленням і наближенням настільної лампи.
Малювально-проекційний апарат РА-5 дозволяє проектувати об'єкт на горизонтальному або вертикальному екрані. При роботі з цим апаратом після налаштування мікроскопа та фокусування препарату призма закриває окуляр і зображення буває видно тільки на аркуші паперу. Працюючи з РА-5 можна скористатися будь-якими об'єктивами мікроскопа, але окуляр може бути вставлений спеціальний — з комплекту рисувального апарата—4х. Працювати з цим малювальним апаратом (можна лише у темному приміщенні при штучному висвітленні препарату).
За допомогою малювального апарата зображення відкидається на аркуш паперу, і це дає можливість гостро відточеним олівцем обвести контури об'єкта, що вивчається. Для отримання повноцінного малюнку його домальовують вже без апарату для малювання. Для цього призму відкидають з окуляра і, дивлячись в окуляр, порівнюють малюнок з об'єктом і домальовують його без рисувального апарату.
Визначення збільшення зображення об'єкта малюнку і столику мікроскопа роблять з допомогою об'єкт-микрометра. Після закінчення малюнка препарат знімають, а столик мікроскопа кладуть об'єкт-микрометр. Користуючись тим самим малювальнимапаратом, на папері поруч із малюнком об'єкта малюють шкалу об'єкт-мікрометра. Вимірявши шкалу, отриману на малюнку, і знаючи її справжні розміри (довжина всієї шкали дорівнює 1 мм, а ціна одного поділу-10. (0,01 мм), неважко визначити, у скільки разів збільшення на папері більше за справжній розмір препарату. Наприклад, у полі зору мікроскопа помістилося 50 поділів об'єкт-мікрометра (0,5 мм).На папері за допомогою рисувального апарату відзначають олівцем місце розташування 1-го та 50-го поділів об'єкт-мікрометра, вимірюють лінійкою відстань між цими поділами і ділять отриману величину на справжню величину поділок об'єкт-мікрометра (50X0,01 мм =0,5 мм) Якщо відстань між крайніми поділами зображення на папері дорівнює 200 мм, тоді видиме збільшення мікроскопа (М) дорівнює 400х (200 мм: 0,5 мм).
Положення паперу стосовно столика мікроскопа залежить від розташування тубуса мікроскопа: при вертикальному положенні тубуса площина паперу має бути суворо паралельна столику мікроскопа. При похилому тубусі папір слід розташовувати на спеціальному столі. Нахил столика повинен бути таким, щоб вісь тубуса мікроскопа при його робочому положенні завжди перпендикулярна поверхні рисувального столика.
Порядок виконання завдання.
1. Налаштувати мікроскоп, сфокусувати об'єкт при відповідному об'єктиві та окулярі 4х із комплекту рисувального апарату.
2. Хомутик апарату надіти на тубус (мікроскопа і закріпити гвинтом на такій висоті, щоб головка апарату рисувального РА-5 розташовувалася на верхній площині оправи окуляра.
3. Пучок променів, що виходять з окуляра мікроскопа, поворотом дзеркала апарату для малювання спроектувати на аркуш паперу.
4. За допомогою мікрогвинта мікроскопа досягтичіткі контури зображення на аркуші паперу. При цьому в приміщенні має бути досить темно, аркуш паперу повинен бути закритий від джерела світла. Тільки в цьому випадку можна отримати яскраве зображення.
5. Замалювати контури зображення. Після того, як контури будуть обведені олівцем, головку апарату для малювання відкидають з окуляра і, дивлячись в окуляр, порівнюють малюнок з препаратом і домальовують деталі.
6. Після закінчення малюнка препарат слід зняти, а на предметний столик покласти об'єкт-мікрометр. Поряд із зображенням об'єкта на папері за допомогою рисувального апарата замалювати всю шкалу об'єкт-мікрометра або частину її та визначити кратність збільшення об'єкта по відношенню до її дійсних розмірів.
Технікавиготовленняпостійних мікропрепаратів
Фіксація та зберігання матеріалу
Сутність фіксації полягає в швидкому умертвіння клітин і тканин, при якому зберігається їхня прижиттєва структура, а всі колоїди переводяться в нерозчинний стан і набувають здатності сприймати барвники. Фіксацію здійснюють шляхом занурення матеріалу в різні отруйні рідини або міцний спирт.
Матеріал, що заготовляється для гістологічних досліджень, зазвичай фіксують 96% розчином етилового спирту і залишають у ньому на зберігання. Однак для фіксації сильно здерев'янілих органів рослин краще взяти 80% його розчин і через кілька днів додати в банки з матеріалом гліцерин (до 1 /з об'єму спирту). Матеріал для ембріологічних досліджень (бутони квіток, пильовики), а іноді і для гістологічних краще фіксувати спеціальними рідинами (наприклад, оцтовим алкоголем або фіксатором Чемберлена). Після закінчення терміну фіксації такий матеріал слід промититрьома змінами 80%-го розчину етилового спирту і зберігати в його розчині такої ж концентрації.
Якщо зрізи готують із живого матеріалу, то для кращої дії фарбників їх необхідно зафіксувати спиртом.
Органи рослин і невеликі рослини, які припускають використовувати для демонстрації, фіксують 4% розчином формаліну і зберігають в 2% його розчині або в суміші 2% розчину формаліну зі спиртом будь-якої концентрації.
Найбільш тонкі зрізи переносять у чисте годинникове скло, в яке наливають за допомогою піпетки невелику кількість водяного розчину барвника. Через кілька хвилин (це залежить від концентрації барвника) барвник видаляють і зрізи кілька разів промивають водою або 50% розчином етилового спирту до повного видалення зайвої фарби. Бажано контролювати це під мікроскопом!
Укладання зрізів у гліцериножелатин
Пофарбовані та промиті зрізи переносять по одному на предметні стекла в заздалегідь підготовлені краплі розплавленого гліцериножелатину. Зручно брати зрізи та переносити їх на мініатюрній дерев'яній лопатці, яку можна легко виготовити, зачистивши ножем другий кінець пензлика або дерев'яну паличку.
У процесі роботи слід підігрівати предметне скло з краплями гліцериножелатину під настільною електричною лампою або на чашці з гарячою водою, закритою великим склом. Іншу краплю гліцериножелатину наносять на чисте покривне скло та акуратно накривають їм зріз. При цьому під покривним склом не повинно залишитися бульбашок повітря. Надлишок гліцериножелатину, що виступив з-під покривного скла, видаляють шматочком фільтрувального паперу. Після застигання середовища препарат готовий. Рекомендують підчистити краї покривного скла і окантувати лаком, оліфою або нітроемальовою фарбою,що подовжить термін придатності препарату.
Укладання зрізів у канадський бальзам
Перед укладанням пофарбованих зрізів у канадський бальзам їх зневоднюють спиртом і просочують розчинником бальзаму - ксилолом. Усі необхідні операції зі зрізами здійснюють в одному або кількох годинних стеклах, застосовуючи піпетки та дерев'яні лопаточки.
У годинниковому склі з пофарбованими зрізами спочатку замінюють воду на 36% розчин етилового спирту. Для кращого зневоднення спиртовий розчин змінюють двічі-тричі, потім замінюють його на абсолютний спирт, абсолютний спирт - на карбоксилол, а останній - на чистий ксилол. Зміну ксилолу проводять двічі-тричі. З ксилолу за допомогою дерев'яної лопаточки чи один? декілька зрізів переносять на чисте предметне скло, наносять на них краплю канадського бальзаму та накривають чистим покривним склом. Рекомендують і на покривне скло нанести невелику краплю бальзаму, що перешкоджатиме появі бульбашок повітря під ним. Надлишок канадського бальзаму, що витікає з-під покривного скла, видаляють за допомогою фільтрувального паперу. Після висихання бальзаму препарат готовий до досліджень.
Виготовлення тимчасових препаратів
При виготовленнітимчасовихпрепаратів об'єкт, що вивчається, поміщають на предметне скло в краплю води або гліцерину, розчину реактиву або барвника і накривають покривним склом. Такий препарат зберігають трохи більше місяця.
Препарати, які можна зберігати триваліший термін, називають постійними.
Література :8, с.185-188
1 Назвіть деталі оптичного мікроскопа та яку роль вони виконують
2 Розкажіть про послідовність роботи з оптичним мікроскопом
3 Як можна дізнатися про збільшення об'єкта?
4 На якій відстані віддосліджуваного об'єкта повинен бути малий і великий об'єктиви?
5 Яку сторону дзеркала використовують для знаходження світла у різних умовах роботи?