Загальна характеристика методів визначення чутливості мікроорганізмів до АХН

Сучасні стандартизовані методи визначення чутливості мікроорганізмів до АБП поділяють на методи серійних розведень та дифузійні.

Методи серійних розведень засновані на прямому визначенні основного кількісного показника, що характеризує мікробіологічну активність АБП - величини мінімальної його переважної концентрації (МПК).

МПК - мінімальна концентрація, що пригнічує видиме зростання досліджуваного мікроорганізму в бульйонній культурі або на щільному середовищі.

Для визначення МПК задані концентрації АБП вносять у живильне середовище, яке потім засівають культурою досліджуваного мікроорганізму, і після інкубації оцінюють наявність або відсутність видимого зростання.

Залежно від характеру використовуваного живильного середовища розрізняють методи серійних розведень в агарі або бульйоні. Залежно від обсягу використовуваного рідкого живильного середовища виділяють методи серійних макро- та мікророзведень.

Різновидом методу серійних розведень є метод, заснований на використанні лише двох концентрацій АБП, відповідних прикордонним значенням (breakpoints) МПК (див. нижче). Цей принцип дослідження широко використовують у автоматизованих системах визначення чутливості мікроорганізмів.

Дифузійні методи визначення чутливості засновані на дифузії АБП з носія в щільне живильне середовище та пригнічення зростання досліджуваної культури у тій зоні, де концентрація АБП перевищує МПК.

В даний час існують дві основні модифікації дифузійного методу: диско-дифузійний та Е-тест.

Е-тест є вузькою смужкою полімеру, (0,5 х 6,0 см), на яку нанесений градієнт концентрацій АБП (від мінімальних до максимальних).Пригнічення зростання мікроорганізму навколо смужки Е-тесту відбувається тільки в тій зоні, де концентрація АБП, що дифузує з носія, вище за МПК, при цьому утворюється краплеподібна зона інгібіції. Значення концентрації АБП у кожній ділянці носія друкарським способом нанесені на зовнішній (звернутій до дослідника) поверхні Е-тесту. Величину МПК враховують там, де межа зони придушення зростання впритул підходить до носія. Детальні інструкції щодо визначення чутливості з використанням Е-тестів додаються виробником до набору реактивів, у зв'язку з цим деталі методу розглядатися не будуть.

Основні етапи проведення тестування

Оцінка антибіотикочутливості незалежно від конкретного методу передбачає послідовне виконання кількох етапів:

приготування живильних середовищ;
приготування суспензії досліджуваних мікроорганізмів (інокулюма);
інокуляція;
інкубація;
облік та інтерпретація результатів, формулювання рекомендацій щодо лікування.

Дифузійні методи включають також етап накладання дисків або смужок Е-тесту на щільне живильне середовище.

Приготування живильних середовищ визначення чутливості

Для оцінки чутливості необхідно використовувати тільки спеціально призначені для цієї мети середовища, які за своїми характеристиками задовольняють вимогам наведеним у розділі 5. від їхнього виробника.

Вид живильного середовища для оцінки чутливості визначається вибраним методом проведення дослідження (агар або бульйон), а також видом тестованогомікроорганізмів.

Вибране живильне середовище для визначення чутливості готується із сухого середовища промислового виробництва відповідно до інструкції виробника. Після автоклавування живильне середовище відразу ж розливають у стерильні пробірки або чашки Петрі, або (якщо необхідно) колби з середовищем поміщають на водяну баню при 48 - 50 ° С, де витримують до досягнення зазначеної температури, після чого в них асептично вносять термолабільні поживні добавки та/або робочі розчини антибіотиків, а потім розливають у пробірки або чашки Петрі.

Агар розливається по чашках шаром завтовшки 4 мм (на чашку діаметром 100 мм потрібно 25 мл агару, на чашку діаметром 90 мм - 20 мл). Чашки залишають за кімнатної температури для застигання. Приготовлені вказаним чином чашки Петрі краще використовувати негайно. Допускається зберігання у запаяних поліетиленових пакетах у холодильнику при + 4 - + 8 ° С протягом 5 діб.

Приготування суспензії досліджуваних мікроорганізмів (інокулюма)

Загальним та принципово важливим для всіх методів тестування є стандартизація суспензії досліджуваного мікроорганізму, її концентрація повинна становити 1,5 x 10 8 КУО/мл. Практично найприйнятнішим методом оцінки концентарації бактеріальної суспензії є вимір її оптичної густини. Оптична щільність бактеріальної суспензії з концентрацією 1,5 x 10 8 КУО/мл при візуальному контролі відповідає стандарту каламутності 0,5 МакФарланду. Контроль оптичної щільності суспензії може здійснюватися також спекторофотометрично (денситометрично). Існують комерційно доступні стандарти каламутності та спектрофотометри. Бактеріальну суспензію можна готувати або з бульйонної або з агарової культури.

Приготуванняінокулюму з агарової культури

Для приготування інокулюму використовують чисту добову культуру мікроорганізмів, що виросли на щільних живильних середовищах. Відбирають кілька однотипних, чітко ізольованих колоній, що виросли на неселективних щільних живильних середовищах. Петлею переносять незначну кількість матеріалу з верхівок колоній в пробірку зі стерильним фізіологічним розчином або поживним бульйоном, доводячи щільність інокулюму до 0,5 за стандартом МакФарланда. Інокулюм слід використовувати протягом 15 хвилин після приготування.

Приготування інокулюму з бульйонної культури

При визначенні чутливості бактерій, що швидко ростуть, із звичайними поживними потребами для приготування інокулюму також можна використовувати 5 - 6 годинну бульйонну культуру мікроорганізму. Для цього відбирають кілька однотипних ізольованих колоній, петлею переносять незначну кількість матеріалу в пробірку з 4,0 - 5,0 мл рідкого неселективного живильного середовища. Інкубують за 35 °С. Приблизно через 5 - 6 годин інкубації щільність мікробної суспензії приблизно відповідає необхідній, і її точно доводять до 0,5 МакФарланд шляхом додавання стерильного бульйону або фізіологічного розчину.

Стандарт Макфарланд може бути або придбаний з комерційних джерел, або приготовлений в лабораторії.