2.3. Якісний та кількісний спектрофотометричний аналіз.
Спектрофотометрія як метод дослідження вирішує 2 основні практичні завдання.Якісназавдання відповідає на запитання про те, чи є взагалі те чи інше з'єднання в досліджуваному зразку.Кількісна, як випливає з її назви, відповідає на питання про те,скількиу зразку цієї речовини.
2.3.1. Якісний спектрофотометричний аналіз.
Вирішення якісних завдань методами спектрофотометрії часто виявляється суттєво складнішим і трудомістким, ніж розв'язання задач кількісних. Справа в тому, що для виявлення присутності (або відсутності) будь-якої сполуки в досліджуваному зразку обов'язково потрібна реєстраціяспектрів поглинанняцього зразка в тому діапазоні довжин хвиль, де з'єднання, що виявляється, має здатність до поглинання світла.
Спектром поглинанняназивається залежність оптичної щільності(D), молярного коефіцієнта поглинання () або поперечного перерізу поглинання () досліджуваного з'єднання від довжини хвилі тестуючого випромінювання (енергії його квантів, їх частоти або хвильових чисел).
Іноді замість спектра поглинання використовується спектр пропускання досліджуваного зразка.
Спектром пропусканняназивається залежність світлопропускання (Т) досліджуваного з'єднання від довжини хвилі тестуючого випромінювання (енергії його квантів, їх частоти або хвильових чисел).
Насправді, проте, спектри пропускання найчастіше застосовують для характеристики світлофільтрів. Для вирішення якісної спектрофотометричної задачі такі спектри менш зручні.
Вирішення якісної задачі на підставі аналізу спектрів поглинання досліджуваного зразка ґрунтується на тому, що у кожного типу молекул є специфічна структураелектронних орбіталей (див. вище) та, відповідно, специфічний спектр поглинання.
Як правило, якісне завдання вирішується шляхом зіставлення спектру зразка істандартногоспектру поглинання з'єднання, що виявляється. Стандартний спектр поглинання з'єднання, що виявляється, в чистому вигляді може бути знайдений в літературі (є, наприклад, спеціальні альбоми спектрів поглинання найбільш поширених речовин) або виміряний самостійно, на тому ж спектрофотометрі, на якому буде вимірюватися спектр поглинання об'єкта, що вивчається. Останній варіант кращий.
Є низка показників поглинання, які можуть використовуватися при вирішенні якісного завдання емпіричним шляхом. Наприклад, якщо з'єднання, що виявляється, володіє поглинанням у видимій області спектру, що містять його зразки (при оптичній щільності 0,06) будуть помітно забарвлені в кольори, додаткові до області поглинання. Розчини гемоглобіну, зокрема, мають червоне забарвлення тому, що гем (хромофорна частина молекули гемоглобіну) поглинає випромінювання у синій та зеленій частинах видимого спектрального діапазону, але не поглинає червоне випромінювання (довше 620 нм). Відомо також, що положення найбільш довгохвильових максимумів на спектрі поглинання залежить від числа сполучених (розділених не більше, ніж однією одинарною-зв'язком) подвійних-зв'язків у молекулі-хромафорі: чим більше кількість таких зв'язків, тим у більш довгохвильовій ділянці (за інших рівних умов) виявляється довгохвильовий максимум. Пов'язано це з тим, що в системі сполучених подвійних-зв'язківp-електрони ділакалізовані по всій цій системі, та їх взаємодія з кожним із ядер, що входять до цієї системи, ослаблено. Квантово-механічні розрахунки показують, що положеннядовгохвильового максимуму (max) у спектрі поглинання при різній кількості сполучених подвійних-зв'язків (N) може бути приблизно визначено за формулою:
деm– маса електрона,з– швидкість світла,h– постійна Планка,l– довжина однієї ланки системи.
Якщо хімічна структура речовини, що виявляється, точно відома, можна приблизно розрахувати положенняmaxдовгохвильової смуги його поглинання за цією формулою. За відсутності подібної смуги у спектрі поглинання об'єкта дане з'єднання в ньому, швидше за все, відсутнє.
Зіставлення спектрів зразка істандартногоспектру поглинання з'єднання, що виявляється проводиться на підставі порівняння так званихякіснихознак смуг поглинання на них. Цих ознак 3:
Точне спектральне положення максимумів поглинання (max).
Співвідношення амплітуд максимумів поглинання (ця ознака застосовується, якщо на стандартному спектрі речовини, що виявляється, є більш, ніж 1 максимум поглинання).
Напівшириною смуги поглинання(1/2)називається її спектральна ширина на половині амплітуди (рис. 4).
Малюнок 4.Схема розрахунку напівширини смуги поглинання (1/2).Для розрахунку цього показника визначається спектральна ширина (2-1) смуги поглинання на половині її амплітуди (1/2Dmax). Як приклад наведено спектр поглинання етанольного розчину 5-метоксипсоралену. По осях:- довжина хвилі тестуючого випромінювання, нм;D– оптичнагустина.
У чистих фізичних об'єктах (наприклад, у розріджених газах), особливо при низьких температурах, близьких до 0 про К, молекули практично не взаємодіють один з одним, через що спектри поглинання мають лінійний вигляд. Однак у розчинах внаслідок взаємодії молекул хромофора з розчинником у кожної молекули відбувається деяка зміна структури електронних орбіталей, причому цей зсув залежить від орієнтації молекул розчинника, ступеня їхньої полярності та відстані до них у момент поглинання кванта випромінювання хромофором. Енергія такого зсуву, таким чином, індивідуальна кожної молекули-хромофора в розчині. Вона не квантована і може набувати будь-яких значень у певному інтервалі. В результаті спектрі поглинання в розчині спостерігається суперпозиція величезного числа зміщених ліній поглинання. Це призводить до того, що замістьлінійпоглинання в таких спектрах спостерігаютьсясмугиз досить великими значеннями1/2. При температурі в 20-25 про С у водних розчинах смуг поглинання на спектрах становить до декількох десятків нанометрів.
Окремі смуги поглинання у таких випадках досить добре описуються кривими Гаусса (рівняння 24) або Лоренца (рівняння 25):
деD– величина оптичної густини зразка при поточній довжині хвилі вимірювання;Dmax- максимальне значення оптичної щільності в смузі (її амплітуда);1/2– напівширина смуги;max– спектральне положення максимуму смуги.
Для того, щоб успішно вирішити якісну спектрофотометричну задачу, важливо, щоб вищезазначені якісні ознаки на виміряному спектрі поглинання можнабуло точно розрахувати. Для цього потрібно, щоб смуги поглинання на аналізованому спектрі добре помітні і розділені досить глибокими мінімумами. Характеристика спектру, яка відображає, наскільки помітні окремі смуги поглинання на ньому, називаєтьсядозвілою.
Для підвищення дозволу смуг на спектрах поглинання їх вимірювання слід проводити при невеликій спектральній ширині пучка випромінювання тестуючого (вона повинна бути в 10 разів менше, ніж півширини смуг поглинання на вимірюваному спектрі). Крім того, оскільки часто спектр поглинання реєструється за окремими точками (навіть в автоматичному режимі), частота розташування точок вимірювання по спектру (інтервал по довжинах хвиль між сусідніми точками) повинна бути не меншою, ніж у 10 разів, менше півширини смуг поглинання. Наприклад, якщо передбачувана напівширина смуги поглинання, що аналізується, – 30 нм, вимірювання оптичної щільності слід проводити не рідше, ніж кожні 3 нм, а при напівширині смуги 10 нм – не рідше, ніж кожен 1 нм.
У фізиці для опису роздільної здатності смуг застосовують так званийкритерій Релея, який формулюється наступним чином:
Дві сусідні смуги поглинання однакової амплітуди та напівширини вважаються повністю дозволеними, якщо глибина провалу між цими смугами становить не менше половини їхньої амплітуди.
На жаль, ряд причин, які наведені нижче, призводить до того, що критерій Релея для оцінки дозволу спектрів поглинання біологічних об'єктів не застосовується. Іноді окремим максимумом поглинання на таких спектрах доводиться вважати смугу, відокремлену від сусідньої просто хоч трохи помітним провалом.
Причини поганого вирішення спектрів поглинання біологічних зразків такі:
Як правило,біологічні зразки багатокомпонентні та містять кілька типів хромофорних молекул. Максимуми поглинання різних типів хромофорів можуть бути розташовані близько один до одного, через що смуги поглинання перекриваються.
Усі біологічні зразки містять воду. Вода, будучи полярним розчинником, схильна до сильної взаємодії із розчиненими в ній сполуками, формуючи навколо них гідратаційні оболонки. Разом з тим, така взаємодія призводить до зміни структури електронних рівнів та підрівнів у молекулах розчинених речовин і, як наслідок, до збільшення напівширин смуг їх поглинання. Це, звісно, також погіршує дозвіл спектрів поглинання.
Біологічні об'єкти, як правило, структуровані. Іншими словами, молекули хромофорів у них не перебувають у вільному стані, а входять до складу складних комплексів надмолекулярних (наприклад, біологічних мембран). Ці надмолекулярні комплекси стабільні завдяки взаємодії входять до них молекул один з одним. Як і взаємодія з розчинником, міжмолекулярні взаємодії призводять до збільшення напівширини смуг поглинання хромофорів, що погіршує роздільну здатність спектрів.
Вимірювання спектрів поглинання біологічних об'єктів зазвичай проводиться у фізіологічному діапазоні температур (від 20 до 40 о С). Однак за шкалою Кельвіна (абсолютною температурною шкалою, яка використовується при описі квантово-механічних процесів, див. вище), це досить високі температури (37 про С = 310 про К), при яких напівширини смуг поглинання виявляються досить великими через заселення електронами віддалених теплових коливальних підрівнів.
Зазначені причини призводять до того, що вирішення якісного завдання в біологічних зразках виявляється дуже утрудненим. Для того, щоб збільшитиДозвіл спектрів поглинання в таких випадках вдаються до спеціальних прийомів, які будуть описані нижче.
Якісна задача вважається вирішеною позитивно (тобто робиться висновок про присутність речовини, що виявляється у зразку), якщо всі 3 якісні ознаки на спектрі поглинання досліджуваного зразка і на стандартному спектрі поглинання сполуки, що виявляється, збігаються або дуже близькі.Наприклад, на стандартному спектрі поглинання розчину чистої речовини А є 2 максимуми поглинання при1та2з напівширинами 25 і 35 нм і з співвідношенням амплітуд 3,2:1. На виміряному спектрі поглинання зразка, що тестується, також є 2 максимуми (можуть бути й інші смуги, але ми звертаємо увагу на ці) при1і2з напівширинами 23 і 36 нм і з співвідношенням амплітуд 3,17:1. У такій ситуації можна з високою ймовірністю стверджувати, що речовина А у вивченому зразкуприсутня.
Можна вирішити якісну задачу і при збігу на спектрі поглинання зразка і стандартному спектрі поглинання з'єднання 1-2 якісних ознак, що виявляється, але в таких випадках ймовірність неправильного укладання сильно зростає.