4. Визначення загального білка у сироватці крові з біуретової реакції
Визначення загального білка по біуретової реакції є на сьогоднішній день найпоширенішимметодом визначення загального білка в сироватці крові. Метод відносно дешевий, простий, має хорошу відтворюваність і специфічність, використання його дозволяє виконувати дослідження як на аналізаторах (автоматичних і напівавтоматичних), так і на звичайному фотометрі.
Для визначеннязагального білка кровіза біуретовою реакцією кров бажано брати вранці натще.
Натрію хлорид, ч. д. а. чи х. ч., 154 ммоль/л (ізотонічний розчин): 9 г хлориду натрію поміщають у мірну колбу місткістю 1 л, розчиняють у воді та доводять до мітки водою.
Натрійкий, ч. д. а. чи х. ч., 0,2 моль/л: 8 г їдкого натру поміщають у мірну колбу місткістю 1 л, обережно розчиняють у воді та доводять до мітки водою.
Калію йодид, ч. д. а. чи х. ч., 30 ммоль/л розчин йодиду калію в 0,2 моль/л розчині їдкого натру: 0,5 г йодиду калію поміщають у мірну колбу місткістю 100 мл, доводять 0,2 моль/л розчином їдкого натру до мітки та розчиняють. Реактив стабільний протягом 2 тижнів при зберіганні у посуді із темного скла.
Калій-натрій виннокислий 4-водний (сегнетова сіль) ч. д. а.
Міді сульфат 5-водний ч. д. а. чи х. год.
Біуретовий реактив: 4,5 г сегнетової солі розчиняють у 40 мл 0,2 моль/л їдкого натру, додають 1,5 г сульфату міді та 0,5 г йодиду калію та розчиняють. Доливають до 100 мл 0,2 моль/л розчином їдкого натру. Реактив стабільний при зберіганні в посуді з темного скла не більше місяця.
Робочий розчин біуретового реактиву: 20 мл біуретового реактиву змішують із 80 мл 0,5% розчину йодиду калію. Реактив зберігають у темному місці не більше 2 тижнів.
Калібрувальний розчин альбуміну (злюдської або бичачої сироватки) - 100 г/л розчин альбуміну в 154 ммоль/л розчині хлориду натрію: 1 г альбуміну з людської або бичачої сироватки розчиняють у 6 - 7 мл 0,9% розчину хлориду натрію і доводять ізотонічним розчином. 10 мл; 1 мл стандартного розчину містить 01 г білка.
Матеріал для дослідження
Для аналізу можна використовувати як сироватка, і плазма. При цьому зазвичай отримують порівняні результати, хоча через присутність фібриногену рівень загального білка в плазмі на 2–4 г/л вищий, ніж у сироватці.
Визначення вмісту білка в сироватці, отриманої у вакуумних системах з гелем, що розділяє, і без нього, дає зіставні результати. Не було отримано суттєвих відмінностей у вмісті білка у зразках крові, зібраних у скляних чи пластмасових вакуумних системах.
Для дослідження не слід використовувати гемолізовану сироватку, оскільки гемоглобін також є білком і вступатиме в біуретову реакцію, що призведе до помилкового завищення результатів аналізу: присутність гемоглобіну призводить до завищення результатів на 3% на 1 г/л вільного гемоглобіну в сироватці.
Небажано використовувати хилезную сироватку, оскільки вона через каламутність оптично інтерферуватиме з результатами визначення, а отже призведе до помилкового завищення результатів. Для усунення інтерференції, викликаної значною ліпемією, застосовують екстракцію діетиловим ефіром. При незначній присутності ліпідів можна провести дослідження, встановивши "бланк" по пробі хворого, або розвести пробу ізотонічним розчином натрію хлориду, а потім помножити результат на ступінь розведення.
Інтерферує дію і білірубін при концентрації більше 85 мкмоль/л. Томуу разі гіпербілірубінемії також використовують або розведення сироватки, або встановлення «бланку» по пробі хворого.
У ряді випадків у реакцію можуть втручатися препарати, що застосовуються для лікування, особливо у тяжких хворих. Так, наприклад, декстрани, що використовуються як плазмозамінні розчини, утворюють комплекс з міддю і тартратом в реакційній суміші і призводять до утворення пухкого синього осаду. Ступінь втручання залежить від концентрації декстрану та складу біуретового реактиву. При зазвичай введених кількостях декстрана величина помилки може становити від 3 до 50%. Вважають, що додавання гліцерину в реактив або використання низької концентрації NaOH здатні запобігти втручанню декстрану в хід реакції. Присутність у зразку іонів амонію може сприяти утворенню комплексів амонію з іонами міді, призводити до зниження концентрації іонів міді в реакційному середовищі, і, відповідно, до зниження швидкості реакції та помилково-негативних результатів. У поодиноких випадках втручання лікарських препаратів, що у сироватці таке, що з взаємодії биуретового реактиву з сироваткою спостерігається або розвиток забарвлення, відмінної від фіолетової, або поява каламутності. Оцінити кількість білка у такій сироватці неможливо.
Вміст загального білка стійкий у сироватці та плазмі протягом 1 тижня при кімнатній температурі і принаймні 2 місяці при -20 °C.
Хід визначення загального білка в сироватці крові з біуретової реакції
Досвідчена проба: до 0,1 мл сироватки додають 5 мл робочого розчину біуретового реактиву і змішують, уникаючи утворення піни. Через 30 хвилин (і не пізніше ніж через годину) вимірюють на фотометрі в кюветі з товщиною шару 1 см при довжині хвилі 500 - 560 нм (зелений світлофільтр) протихолостий проби.
Холоста проба: до 5 мл робочого біуретового реактиву додають 0,1 мл 154 ммоль/л розчину натрію хлориду, далі обробляють як дослідну пробу.
Розрахунок ведуть за калібрувальним графіком.
Побудова калібрувального графіка: з калібрувального розчину готують робочі розчини, як зазначено нижче.
Калібрувальний розчин альбуміну, мл
154 ммоль/л розчин хлориду натрію, мл