58. Імуноферментний метод чи аналіз
ІФА — найпоширеніший сучасний метод, який використовується для діагностики вірусних, бактеріальних, протозойних інфекцій, зокрема для діагностики ВІЛ-інфекції, вірусних гепатитів та ін.
Модифікацій ІФА дуже багато. Широко використовується неконкурентний твердофазний варіант ІФА. Його проводять у 96-лункових полістиролових планшетах (тверда фаза). При
проведенні реакції необхідно на кожному етапі відмивати компоненти, що не прореагували. При визначенні антитіл у лунки, на яких сорбовані антигени, вносять сироватку крові, що досліджується, потім антиглобулінову сироватку, мічену ферментом. Виявляють реакцію, додаючи субстрат ферменту. У присутності ферменту субстрат змінюється, причому фермснтсубстратний комплекс підбирають таким чином, щоб продукт, що утворюється в реакції, був кольоровим. Таким чином, при позитивній реакції спостерігається зміна кольору розчину. Для визначення антигенів твердофазний носій сенсибілізується антитілами, потім послідовно вносяться досліджуваний матеріал (антигени) та сироватка до антигенів, мічена ферментом. Для прояву реакції вносять субстрат ферменту. Зміна кольору розчину відбувається за позитивної реакції.
Цей метод заснований на поєднанні електрофорезу та ІФА. При проведенні імуноблотінгу (блот від англ. Blot - пляма) складну суміш антигенів спочатку піддають електрофорезу в поліакриламідному гелі. Отримані фракціоновані антигенні пептиди переносять на нітроцелюлозну мембрану. Потім блоти обробляють антитілами до специфічного антигену, міченими ферментом, тобто. проводять ІФА блоти. Імуноблоттинг використовують у діагностиці інфекцій, наприклад ВІЛ
59. Імунна електронна мікроскопія
Метод полягає в мікроскопуванні велектронному мікроскопі вірусів (рідше інших мікробів), попередньо оброблених відповідною імунною сироваткою, міченою електроннооптично-щільними препаратами, наприклад феритином — залізовмісним білком
60. Проточна цитометрія
Клітини крові диференціюють на основі лазерної цитофлюорометрії. Для цього клітини забарвлюють флюоресцентними моноклональними антитілами до CD-антигенів. Зразок крові після обробки міченими антитілами пропускають через тонку трубку та через нього пропускають лазерний промінь, який збуджує свічення флюорохрому. Інтенсивність флюоресценції корелює із щільністю антигенів на поверхні клітин і може бути кількісно виміряна за допомогою фотопомножувача.
61. Серологічні реакції, що використовуються для діагностики вірусних інфекцій.
Імунні реакціївикористовують при діагностичних та імунологічних дослідженнях у хворих та здорових людей. З цією метою застосовуютьсерологічні методи, тобто методи вивчення антитіл та антигенів за допомогою реакцій антиген-антитіло, що визначаються в сироватці крові та інших рідинах, а також тканинах організму.
Виявлення у сироватці кровіхворого антитіл проти антигенів збудника дозволяє поставити діагноз хвороби. Серологічні дослідження застосовують також для ідентифікації антигенів мікробів, різних біологічно активних речовин, груп крові, тканинних та пухлинних антигенів, імунних комплексів, рецепторів клітин та ін.
При виділенні мікробавід хворого проводять ідентифікацію збудника шляхом вивчення його антигенних властивостей за допомогою імунних діагностичних сироваток, тобто сироваток крові гіперімунізованих тварин, що містять специфічні антитіла. Це так званасерологічна ідентифікаціямікроорганізмів.
У мікробіології та імунології широко застосовуютьсяреакції аглютинації, преципітації, нейтралізації, реакції за участю комплементу, з використанням мічених антитіл та антигенів (радіоімунологічний, імуноферментний, імунофлюоресцентний методи). Перераховані реакції розрізняються за реєстрованим ефектом і технікою постановки, проте, всі вони засновані на реакції взаємодії антигену з антитілом і застосовуються для виявлення антитіл, так і антигенів. Реакції імунітету характеризуються високою чутливістю та специфічністю.
Особливості взаємодії антитіла з антигеномє основою діагностичних реакцій у лабораторіях. Реакціяin vitroміж антигеном та антитілом складається зі специфічної та неспецифічної фази. Успецифічну фазувідбувається швидке специфічне зв'язування активного центру антитіла з детермінантою антигену. Потім настає неспецифічна фаза - повільніша, яка проявляється видимими фізичними явищами, наприклад утворенням пластівців (феномен аглютинації) або преципітату у вигляді помутніння. Ця фаза потребує певних умов (електролітів, оптимального рН середовища).
Зв'язування детермінанти антигену (епітопу) з активним центром Fab-фрагменту антитіл обумовлено ван-дер-ваальсовими силами, водневими зв'язками та гідрофобною взаємодією. Міцність і кількість антигену, що зв'язався, антитілами залежать від афінності, авидності антитіл та їх валентності.