8. Методи серологічної діагностики

Серологічні методи дослідження, як правило, мають додаткове значення, і лише в окремих випадках під час проведення оперативного та ретроспективного епідеміологічного аналізу їх результати можуть бути вирішальними.

Для серологічної діагностики холери використовують імунологічні реакції, що виявляють у сироватці крові хворих, перехворілих та вібріононосіїв, а також вакцинованих специфічні антитіла: аглютиніни, антитоксини та вібріоцидні антитіла.

У хворих на холеру на 5 - 7-й день від початку захворювання з'являються аглютиніни, вібріоцидні антитіла та антитоксини.

Доцільно дослідити парні сироватки з інтервалом у 7 – 10 днів. Перша проба повинна бути взята на 5 – 7-й день для оперативної діагностики та друга – через 7 – 10 днів і більше – для ретроспективної.

Кров для серологічних досліджень беруть із вени, а за відсутності такої можливості – з пальця. З вени беруть 1 - 5 мл крові, після згортання потік відшаровують від стінки пробірки стерильною скляною паличкою або платинової петлею. Пробірки зберігають у холодильнику та транспортують до лабораторії охолодженими (у термосі, сумці-холодильнику та ін.). У лабораторії сироватку інактивують за температури (56,0 +/- 0,5) °С 30 хв.

Якщо кров забирають у день постановки реакції, пробірки з кров'ю, що згорнулася, необхідно центрифугувати 10 - 15 хв. при 3000 об/хв. За відсутності можливості досліджувати сироватку, негайно її зберігають в ампулах при температурі (4,0 +/- 0,5) °С. Кров з пальця беруть об'ємом 0,4 мл і вносять у стерильний пеніциліновий флакон або пробірку з 1,6 мл 0,9% розчину хлориду натрію (1:5).

А. Виявлення протихолерних антитіл методом розгорнутої реакції аглютинації

Досліджувану сироватку розводять 1% пептонною водою рН 7,5 +/- 0,1 в об'ємі 1 мл від 1:10 до 1:640. Як антиген використовують 3-годинну бульйонну культуру, виділену в даному осередку, або досліджують в 3-х рядах з культурами холерних вібріонів (сероварів Огава, Інаба і О139 серогрупи). У пробірку з розтитрованою сироваткою вносять по 1 краплі культури-антигену і ставлять на 1 год термостат, потім до ранку в холодильник при температурі (4,0 +/- 0,5) °С, після чого відзначають результати. Реакція супроводжується контролюми антигену та сироватки.

При визначенні титру реакції враховують розведення з аглютинацією на 3 – 4 хрести.

Результат дослідження сироватки хворого при реакції аглютинації у розведенні 1:40 і вище вважається орієнтовно позитивним.

Діагностичне значення має щонайменше 4-кратное наростання титрів антитіл.

Б. Реакція непрямої гемаглютинації (РНГА) з діагностикумом еритроцитарним антигенним холерним

Для виявлення повних антитіл у сироватці крові призначена РНГА. Це досить специфічна та чутлива двокомпонентна реакція. За чутливістю значно перевищує реакцію аглютинації. Необхідні інгредієнти, методика постановки в макро- та мікрооб'ємах викладені у настанові до діагностикуму еритроцитарного антигенного холерного.

Результат дослідження сироватки хворого у розведенні 1:40 і вище вважається орієнтовно позитивним.

Діагностичне значення має щонайменше 4-кратное наростання титрів антитіл.

В. Реакція нейтралізації антигену (РНАг)

Для виявлення антитіл у сироватці крові з використанням діагностикуму еритроцитарного холерного імуноглобулінового служить РНАг. Реакція нейтралізації антигену – високоспецифічна трикомпонентнареакція. Її принцип полягає в специфічній нейтралізації антигену, що додається як повними, так і неповними антитілами, які з'являються раніше інших. Необхідні інгредієнти, методика постановки в макро- та мікрооб'ємах викладені в інструкціях щодо застосування діагностикуму еритроцитарного холерного імуноглобулінового.

З використанням системи реакцій РНГА і РНАг відпадає необхідність у постановці контролю специфічності з кожною досліджуваної сироваткою, т.к. ці дві реакції взаємно контролюють одержані результати.

Результат дослідження сироватки хворого на РНАг у розведенні 1:50 (1:80) і вище вважається орієнтовно позитивним.

Діагностичне значення має не менше ніж 4-кратне наростання титрів антитіл при дослідженні парних сироваток у РНГА та РНАГ.

Вібріоцидні антитіла у крові хворих виявляються та досягають максимальних значень 10(-4) - 10(-8) до 10 - 12 дня. Принцип методу у всіх його варіантах полягає в тому, що у присутності вібріоцидних антитіл не відбувається розмноження холерних вібріонів.

При проведенні серологічних досліджень в осередку, зумовленому збудником холери певного серовару, реакції використовують один штам відповідного серовару, при відсутності цих даних - два штами обох сероварів.

Матеріали та обладнання:

- досліджувані сироватки, інактивовані прогріванням 30 хв. за температури (56,0 +/- 0,5) °С;

- сухий комплемент або свіжоодержана сироватка морської свинки у розведенні 1:20;

- 0,9% розчин хлориду натрію рН 7,2 +/- 0,1;

- штами холерних вібріонів сероварів Огава та Інаба, типові в S-формі, не чутливі до комплементу;

- чашки Петрі із лужним агаром;

- термостат (37,0 +/- 1,0) °С.

Методика постановки реакції

Комплемент, розведений 0,9% розчином хлориду натрію 1:20, розливають у два ряди пробірок по 0,9 мл. У першу пробірку вносять 0,1 мл досліджуваної сироватки і після ретельного перемішування послідовно переносять по 0,1 мл до розведення 10(-10), одержуючи десятикратні розведення сироватки обсягом 0,9 мл. Титрацію сироватки проводять на льоду, який поміщають у будь-яку ємність.

З однодобової агарової культури холерного вібріона готують завись в 0,9% розчині хлориду натрію, що містить в 1 мл 1 - 2 х 10(4) м.к. Стерильною градуйованою піпеткою одержану завись по 0,1 мл вносять у дослідні пробірки з розтитрованою сироваткою.

Необхідні такі контролі: а) контроль комплементу (0,9 мл комплементу та 0,1 мл культури); б) контроль сироватки (0,8 мл 0,9%-го розчину хлориду натрію, 0,1 мл сироватки та 0,1 мл культури); в) контроль культури (0,9 мл 0,9% розчину хлориду натрію і 0,1 мл культури).

Штатив з пробірками на 1 год поміщають у водяну баню або термостат при температурі (37,0 +/- 0,5) °С, зробивши попередньо висів з пробірки контролю культури на 2 пластинки лужного агару для визначення фактичної концентрації живих вібріонів у дослідній суспензії ( контроль розведення).

Через 1 год штатив знову ставлять на лід і з кожної пробірки окремою піпеткою стерильною 0,1 мл культури висівають на чашку з лужним агаром рН 7,0 +/- 0,1. Посів рівномірно розподіляють поверхнею чашки погойдуванням чи шпателем. Чашки поміщають на 18 - 24 год термостат при температурі (37,0 +/- 0,5) °С, після чого підраховують кількість колоній, що виросли.

У посівах із контрольних пробірок із культурою має зростати кількість колоній, близька до контролю розведення.

Вібріоцидним титром вважаютьмаксимальне розведення сироватки, що спричиняє загибель не менше ніж 50% клітин холерного вібріона, що виявляється при сівбі на агарові пластинки в чашки Петрі порівняно з кількістю колоній, що виросли, з пробірки контролю комплементу.

Приклад обчислення: при сівбі з дослідних пробірок з розведенням сироватки 10(-1); 10(-2); 10(-3); 10(-4); 10(-5); 10(-6); 10(-7) і т.д. на чашках відповідно виросло 0; 0; 5; 10; 15; 30; 38 і т.д. колоній. При висіві з пробірки контролю комплементу після годинної інкубації при температурі (37,0 +/- 0,5) °С зросло 36 колоній, 50% від цього числа становитиме 18. З 5-ї пробірки виросло 15 колоній, тобто . менше 50% кількості колоній у контролі (18), у наступній - 30, тобто. більше 50% цього ж показника. Розведення сироватки в 5 пробірці становить 10(-5), отже, вібріоцидний титр в даному прикладі становитиме 10(-5).

Визначення вібріоцидних антитіл (ВА) у сироватці крові на основі ферментації вуглеводів

Про відсутність або наявність ВА судять щодо ферментації сахарози, що реєструється за допомогою індикатора.

Матеріали та обладнання:

- інактивована сироватка крові;

- штами холерного вібріона серовара Огава та Інаба;

- комплемент, розведений 1:20 1% пептонною водою, що містить 1% сахарози і 1% індикатора Андреде;

- термостат (37,0 +/- 1) °С.

Методика постановки реакції

Комплемент, розведений 1:20 1% пептонною водою з сахарозою та індикатором Андреде розливають у пробірки по 0,45 мл. У першу пробірку додають 0,05 мл досліджуваної сироватки і після ретельного перемішування переносять 0,05 мл суміші в другу пробірку, другий в третю і т.д. (До розведення 10(-5) - 10(-9)). Готують суспензію 18 - 20-годинної агарової культурихолерного вібріона і розводять 1% пептонною водою до концентрації 10(3) м.к./мл. У всі пробірки вносять по 0,45 мл суспензії та поміщають у термостат.

Постановку реакції супроводжують такими контролюми:

- 0,45 мл 1% пептонної води, що містить 1% сахарози і 1% індикатора Андреде + 0,05 мл досліджуваної сироватки + 0,45 мл суспензії культури - контроль сироватки;

- 0,45 мл комплементу з сахарозою та індикатором + 0,45 мл культури - контроль комплементу;

- 0,45 мл 1% пептонної води з сахарозою та індикатором + 0,45 мл культури - контроль культури;

- 0,45 мл 1% пептонної води з сахарозою та індикатором + 0,05 мл досліджуваної сироватки - контроль стерильності сироватки.

Через 5 - 6 годин проводять облік реакції. При цьому в контролі (крім контролю стерильності сироватки) колір вмісту пробірок повинен перейти в рожевий або червоний. Зміна кольору індикатора в пробірках робочого ряду, пов'язане з ферментацією сахарози вібріонами, що розмножилися, свідчить про відсутність вібріоцидних антитіл в досліджуваній сироватці. За вібріоцидний титр приймають найбільше розведення сироватки, при якому колір вмісту пробірок залишається незміненим або інтенсивність його значно відрізняється від забарвлення контрольних проб. Результат виражають у вигляді десяткового логарифму розведення сироватки, взятого зі зворотним знаком.

Примітка. Для постановки РВА при холері, обумовленої холерним вібріоном О139 серогрупи, не може бути використаний виділений в осередку штам у зв'язку з можливою чутливістю до комплементу. У цих випадках рекомендується запропонований фахівцями Ростовського НІПЧІ, ctx-клон холерного вібріона О139, спрямований на депонування до Державної колекції патогенних бактерій "Мікроб" (РосНДПЧІ "Мікроб").

Для виявлення токсиннейтралізуючих антитіл у сироватці крові хворих на холеру та вібріононосіїв призначена РНГА з еритроцитарним холерним ентеротоксичним діагностикумом (ЕХЕД), у яких інфікування обумовлено холерними вібріонами О1 та О139 серогруп. Токсиннейтралізуючі антитіла з'являються на 5 - 7 день хвороби, досягаючи максимуму на 14 - 21 день, потім їх титр поступово знижується, але зберігається довше інших антитіл. Імуноглобуліни до холерного токсину порівняно з вібріоцидними та іншими специфічними холерними антитілами довше циркулюють у сироватці після перенесеної інфекції (до 8 - 10 і більше місяців). Умовно позитивним титром РНГА з ехед слід вважати 1:160 і вище. Доцільно досліджувати парні сироватки.

Результат РНГА з ЕХЕД дозволяє зробити висновок про токсигенність (епідемічність) штаму холерного вібріону, що циркулює в осередку, в тому числі і без виділення культури.