Автореферат докторської дисертації з біології

5.Результати вивчення можливості практичного застосуванняштамів-деструкторів

Результати досліджень, наведені вище, вказують на доцільність практичного застосування знову виділених штамів, зокрема, для очищення об'єктів, забруднених фенолом та його галогеновмісними похідними, а також для створення invitronових штамів, здатних змінювати властивості молекул хлорфеноксикислот у бік їхньої детоксикації та зниження стійкості середовище.

5.1.Використання штамів-деструкторів для ремедіації навколишнього середовища

Перспективи використання штамів-деструкторів з метою поліпшення якості очищення промислових стоків від фенолів було визначено під час досліджень, вкладених у зниження вмісту фенолів у стоках підприємств нафтохімічного профілю.

В результаті випробувань штамів в умовах реальних стічних вод, характерних для нафтохімічного виробництва Північного промислового вузла РБ, виявили, що культури A. globiformis17S, В. cereus34Т, В. subtilis16, G. oxydans2Т і S. marcescens22S здатні ефективно знижувати концентрацію фенолу і похідних в умовах забрудненого водного середовища та ґрунту.

Культура A. globiformis17S виявила активність в умовах комплексу забруднень стічних вод виробництва дубильних екстрактів ВАТ «Дубитель» та ВАТ «Ново-Уфимський НПЗ» (табл. 5).

Таблиця 5 – Результати аналізу вмісту фенолів у стоках ВАТ «Новоуфимський НПЗ» та ВАТ «Дубитель» при застосуванні культури А. globiformis17S

ЧАС ОБРОБКИ (ДОБИ)

Проби стічних вод

Зміст фенолів устічних водах, мг/л

Зміст фенолів від контролю, %

Помітна зміна вмісту фенолів у стічних водах при використанні A. globiformis17S спостерігалася після 3 доби обробки. Ступінь очищення стічних вод, що досягається при застосуванні штаму А. globiformis17S, становила для стоків нафтохімічного виробництва 88,4%, а виробництва дубильних екстрактів – 90,7%.

Культура Ст subtilis16 проявила активність в умовах стічних вод нафтохімічного виробництва ВАТ «Уфахімпром».

Таблиця 6 - Результати аналізу вмісту фенолів у стоках нафтохімічного виробництва ВАТ «Уфахімпром» при застосуванні культури Ст subtilis16

ЧАС ОБРОБКИ (ДОБИ)

Проби стічної води

з додаванням поживних солей

Зміст фенолів від контролю, %

Культура S. marcescens22 S була активною в реальних умовах стічних вод нафтохімічного виробництва та виробництва дубильних екстрактів.

Таблиця 7 - Результати аналізу вмісту фенолів у стоках ВАТ «Новоуфімський НПЗ» та ВАТ «Дубитель» при застосуванні культури S.

marcescens 22 S

ЧАС ОБРОБКИ (ДОБИ)

Проби стічних вод ВАТ «Новоуфимський НПЗ»

Проби стічних вод ВАТ «Дубитель»

Ступінь очищення стічних вод від фенолів, що досягається при використанні штаму S. marcescens22 S, протягом 3 діб для стоків виробництва дубильних екстрактів становила 87,3%, а при застосуванні до стоків нафтохімічного виробництва становила 75,7% на 3 добу та 88 ,6% на 7 добу обробки (табл. 7).

Деградацію 2,4,5-Т у грунті здійснювали культури Ст cereus34Т і G. oxydans2Т.

Істотна зміна вмісту 2,4,5-Т спостерігалася після 10-14 днів обробітку ґрунту В. cereus34Т.Через 5 діб інкубації кількість 2,4,5-Т зменшувалася на 35,8%, далі до 14-ї доби - приблизно на 50% і згодом залишалося на цьому рівні (табл. 8). Ступінь очищення грунту, що досягається при використанні штаму G. oxydans2Т, становила відповідно: 27,4% на 21 добу культивування, 31,9% на 30 добу і близько 66,5% на 48 добу.

Таблиця 8 - Результати аналізу вмісту 2,4,5-Т у ґрунті при застосуванні культури В. cereus34Т та G. oxydans2Т

ЧАС ОБРОБКИ ҐРУНТУ, ДОБИ

Вміст 2,4,5-Т у ґрунті, мг/г

Ступінь очищення до контролю, %

культура G. oxydans 2Т

Вміст 2,4,5-Т у ґрунті, мг/г

Ступінь очищення до контролю, %

Наведене вище показує, що застосування культур В. cereus34Т та G. oxydans2Т є перспективним для очищення ґрунту від 2,4,5-Т.

5.2.Використання штамуBacillussubtilis16 для створення штаму-деструктора із заданими властивостямиinvitro

Створення рекомбінантного штаму-деструктора проводили шляхом клонування детермінант деградації 2,4-Д штаму Bacillussubtilis16 у складі вектора pBR322 у клітинах E.coliНВ101.

Рекомбінантні клітини E.coliселектували на рідкому середовищі М9, що містить 2,4-Д як єдине джерело вуглецю та енергії.

Порівняльний аналіз вмісту 2,4-Д та продуктів її деградації у пробах культуральної рідини E.coliрМК 16 показав, що кількість 2,4-Д до 14 діб інкубації знижувалася на 88,9%. Для штаму Ст subtilis16 до 14-ї доби інкубації концентрація 2,4-Д в культуральній рідині знижувалася приблизно на 78% від початкового рівня.

З використанням методу газо-рідинної хроматографії та хромато-мас-спектрометрії проведено порівняння продуктів метаболізму2,4-Д, що накопичуються в культуральній рідині Ст subtilis16, E.colipBR322 і E.coliрМК16, і виявлено їх схожість, а саме, в якості інтермедіату штами утворювали 5-оксиметил-2,4-дихлорфеноксиоцтову кислоту.

Наведені дані вказують на те, що штами E.coliрМК 16 і штам В. subtilis16 мають сумірну деструктивну здатність щодо 2,4-Д і утворюють однакові інтермедіати конверсії.

Аналіз структури рекомбінантної плазміди штаму E.coliрМК16 показав, що плазміда штаму E.coliрМК16 має розмір 8,8 т.п. і складається з векторної молекули pBR 322 (А) та двох BamHI-фрагментів, розмір яких становить 3,1 т.п.н. (В) та 1,3 т.п.н. (С).

Новий рекомбінантний клон E.coli з генотипом 2,4-Д+, був позначений як штам E.coliрМК16.

На основі наведених відомостей, що демонструють приклади практичного використання нових штамів-деструкторів, стає можливим сформулювати сферу їх застосування в цілому, а саме:

очищення/доочищення стічних вод підприємств хімічного та нафтохімічного профілю від фенолу та його хлорованих похідних;
детоксикація та очищення ґрунту від фенолу та його хлорованих похідних у випадках локального забруднення;
створення нових штамів-деструкторів із заданими властивостями invitro.

Присутність в навколишньому середовищі стійких синтетичних сполук ароматичного ряду створює одну з труднощів у сфері підтримки якості довкілля людини.

До теперішнього часу сформовано уявлення про те, що мікроорганізми, що мають специфічні катаболічні здібності щодо ксенобіотиків, можуть використовуватися для захисту та очищення середовища як діючих елементів біологічних технологій нового.покоління.

Разом з тим аналіз результатів експериментальних робіт у галузі біоконверсії екотоксикантів виявляє слабку дослідженість фундаментальних питань, пов'язаних з описом властивостей окремих культур, що утилізують політанти, а також недостатність знань про організацію та функціонування їх консорціумів. Виявляється також неповне розуміння суті механізмів біохімічних перетворень молекул забруднювачів, недостатні відомості про особливості генетичної будови деструкторів.

У ході справжньої роботи із змішаних популяцій ґрунтової біоти, що зазнавала тривалого впливу техногенних факторів, було виділено нові бактеріальні культури, здатні до асиміляції фенолу та його галогенідів.

Вивчення характеристик знову виділених штамів дозволило суттєво розширити уявлення про біорізноманіття сучасних деструкторів.

Зокрема, із застосуванням молекулярних критеріїв систематики були диференційовані нові види гамма-підкласу протеобактерій пологів Citrobacter, Stenotrophomonas і Xanthomonas.

Вперше було виявлено, що представники пологів Agrobacterium, Agromyces, Azospirillum, Brenneria, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonas і Xanthomonas здатні залучати в обмін речовин і енергії фенол, 2,4-ДХФ, 4, 2,4-ДХФ, 4 та 2,4,5-Т.

Для представників пологів Achromobacter, Agrobacterium, Bacillus, Citrobacter, Gluconobacter, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonas і Xanthomonas вперше були описані етапи асиміляції хлорфеноксикислот і показано, що конверсія молекул ксенобіотиків відбувається з утворенням дегал розщепленню до альдегіду гексенової кислоти, діоксогексендіонової кислоти абогексеналю. При цьому вперше був виявлений мета-шлях конверсії 2,4,5-Т у штамів пологів Achromobacter, Gluconobacter, Pseudomonas, Raoultella, Stenotrophomonas і Xanthomonas, а також встановлено, що конверсія хлорфеноксикислот у представників роду Bacillus відбувається через формування гідрок.

У геномах бактерій, що належать родам Citrobacter, Pseudomonas, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonas і Xanthomonas, виявлені

оригінальні плазміди, що несуть генетичні детермінанти контролю за реакціями асиміляції хлорфеноксиоцтових кислот. Ці плазміди були класифіковані як нові D-плазміди бактерій-деструкторів. Виявлено, що плазміди штамів роду Raoultella здатні до горизонтального перенесення та експресії детермінант деградації хлорфеноксикислот в інших бактеріальних господарях у повному обсязі.

Показано, що генетичні системи контролю конверсії ксенобіотиків нововиявлених штамів суттєво відрізняються від відомих.

Слід підкреслити, що у цій роботі вивчення природних деструкторів було націлено як розуміння теоретичних основ різноманіття проявів життя, а й пов'язувалося з прагненням використовувати отримані дані практично як ключа, який відкриває можливості розробки безпечних технологій збереження довкілля. Тому було вивчено принципову можливість використання нових штамів-деструкторів для доочищення від фенолів стоків підприємств нафтохімічного профілю, а також показано перспективи застосування їх генетичних елементів для дизайну штамів із заданими властивостями invitro.

Автореферат докторської дисертації з біології - Бактерії-деструктори фенолу та його хлорованих