Біологічний каталог Посібник з практичних занять з мікробіології стор 39
ментами, наявність яких
тестується. Такі субстрати або просто додають у середу, або обприскують ними середовища у чашках після того, як на них виросли колонії. Як хромогенний субстрат широко використовують X-gal (5-бром4-хлор-3-індоліл-1р-0-галактозид), за допомогою якого виявляють наявність [3-галактозидази, одного з ферментів, необхідних для утилізації лактози. Клітини, що синтезують (J-галактозидазу, розщеплюють X-gal з утворенням 5-бром-4-хлориндиго, який забарвлює колонії у яскраво-синій колір.
Метод відбитків. Один із широко використовуваних методів виявлення мутантів отримав назву методу відбитків, або реплік. Чашки Петрі з повноцінним агаризованим неселективним середовищем засівають мутагенізованою культурою або суспензією клітин у відповідному розведенні, отримуючи таким чином вихідну матричну чашку. Після появи колоній до поверхні середовища в чашці торкаються шматочком стерильного оксамиту, натягнутого на циліндричну болванку (рис. 70). Замість оксамиту можна користуватися фільтрувальним папером. На поверхню оксамиту переносяться (віддруковуються) клітини з колоній. Після цього оксамит прикладають до поверхні середовища в чашці або чашках з селективними середовищами. Таким чином, можна зробити до 10 відбитків (реплік). Колонії, які ростуть на неселективному середовищі, але не ростуть на якомусь селективному середовищі, перевіряють на наявність мутацій. Метод відбитків за короткий час дозволяє перевірити тисячі колоній та особливо корисний для виявлення ауксотрофів.
Вихідну матричну чашку можна приготувати іншим способом: за допомогою голчастого реплікатора (рис. 71). Таким стерильним голчастим реплікатором, що має 50-100 циліндричних голок, розташованих у певному порядку, злегка торкаються поверхні неселективної.середовища у чашці. Цю операцію слід проводити акуратно, щоб голки не проколювали агар. Потім за допомогою стерильних сірників або стерильних загострених смужок товстого паперу переносять клітини з колоній чашок, на яких виросли мутагенізовані клітини, на матричну чашку на сліди уколів. Після інкубації матричної чашки до утворення колоній за допомогою того ж таки реплікатора роблять відбитки на ряд селективних середовищ.
10.3.3. Пеніциліновий метод збагачення мутантними клітинами у бактерій
Виникнення мутацій, навіть за їх індукції сильними мутагенами, — рідкісна подія. При прямих методах селекції ця обставина не відіграє суттєвої ролі, оскільки за допомогою селективних середовищ елімінуються всі немантатні клітини. При використанні непрямих методів низька частота мутування може стати фактором, що обмежує їх роздільну здатність, оскільки пошук рідкісних мутантних колоній доводиться проводити на значному тлі немутантних колоній. Підвищити частоту мутантних клітин у популяції можна за допомогою методу збагачення, елімінуючи значну частину немутантних клітин. При роботі з бактеріями найчастіше використовують пеніциліновий метод збагачення. Пеніцилін пригнічує синтез клітинної стінки (муреїну) і викликає загибель тільки клітин, що активно ростуть. Якщо культуру, що містить мутантні (наприклад, ауксотрофні) і немутантние клітини, вирощувати на мінімальному середовищі, то в такому середовищі будуть розмножуватися тільки немутантні клітини. Після внесення в таке середовище пеніциліну відбувається загибель немутантних клітин, і популяція збагачується мутантами. За оптимальних умов можна досягти 1000-кратного збагачення культури мутантами.
При використанні пеніцилінового методу необхідно дотримуватись ряд умов.
1. Оброблюванапеніциліном суспензія або культура повинна містити не більше 107 клітин/мл. При використанні більш густих суспензій продукти лізису клітин, загиблих від пеніциліну, можуть бути джерелами ростових факторів для мутантних клітин, внаслідок чого вони почнуть зростати і також діяти пеніциліну.
2. Перед обробкою пеніциліном бактерії повинні бути проінкубовані в мінімальному середовищі протягом часу, достатнього для 3-4 поділів. За цей період відбувається виснаження ендогенних метаболітів у мутантних клітинах, що захищає їхню відмінність від загибелі в присутності пеніциліну.
10.4. ПЕРЕНОС ГЕНЕТИЧНОЇ ІНФОРМАЦІЇ У БАКТЕРІЙ
У бактерій існують три способи, або процесу перенесення генетичної інформації, що призводять до рекомбінації генетичного матеріалу: трансформація, кон'югація і трансдукція, що широко використовуються в генетичних експериментах.
Трансформацією називають процес перенесення генетичної інформації, в результаті якого екзогенна ДНК проникає в реципієнтну клітину та викликає її спадкові зміни.
У цьому ДНК може бути весь донорний геном чи його частина.
Передачу в клітину цілого геному фага, що веде до утворення в них зрілих фагових частинок, називають трансфекцією. За способом перенесення ДНК у бактеріальну клітину цей процес є трансформацією, проте на відміну від останньої в результаті трансфекції відбувається лізис клітини, а не спадкову зміну.
Кон'югацією називають процес перенесення генетичної інформації з клітини-донора в клітину-реципієнт, який здійснюється при безпосередньому контакті між собою.
Трансдукцією називають процес перенесення генетичної інформації з клітини-донора в клітину-реципієнт, який здійснюється фагом.
Загальною властивістю всіхтрьох процесів є їх односпрямованість, т. е. завжди одна клітина виступає у ролі донора ДНК, іншу — у ролі реципієнта. Взаємного (реципрокного) обміну генетичної інформації у бактерій немає.
У експериментальній роботі найчастіше використовують методи, засновані на процесах трансформації та кон'югації.
Трансформація може здійснюватися як хромосомною, і плазмидной ДНК. Реципієнтна клітина, де відбувається експресія генетичного матеріалу донора, називається трансформантом. Важлива умова здатності клітини до трансформації – розвиток у неї особливого фізіологічного стану – компетентності. По розвитку компетентності мікроорганізми можна розділити на три групи.
1. Мікроорганізми, у яких компетентність виникає лише у певній фазі зростання культури (наприклад, стрептококи, бацили).
2. Мікроорганізми, клітини яких компетентні у будь-якій фазі росту (наприклад, гонококи, менінгококи).
3. Мікроорганізми із відсутністю природної компетенції. Клітини таких мікроорганізмів стають компетентними лише після спеціальної обробки (наприклад, клітини Е. coli стають компетентними після обробки на холоді хлористим кальцієм).
Посів трансформованих клітин на селективні середовища необхідно проводити після певного часу їх інкубації в багатому поживному середовищі. У період такої інкубації в клітинах-трансформантах відбувається експресія отриманих ними нових маркерів (генів) і вони набувають нового фенотипу.
У ряду мікроорганізмів з природною компетентністю всередину клітини проникає лише однониткова ДНК. Тому трансформація плазмідними ДНК, які знаходяться в ковалентно-замкнутій суперскрученій формі, не здійснюється або здійснюється з низькоюефективністю. Щоб збільшити ефективність трансформації, слід попередньо отримати протопласти клітин.
При проведенні трансформації у бактерій із природною стадією компетентності необхідно враховувати фактори, що впливають на такий стан: температуру, склад середовища та його рН, наявність певних концентрацій двовалентних катіонів.
Останнім часом поширення набув метод трансформації, названий електропорацією. Електропорація - введення ДНК у клітини за допомогою електричних імпульсів, що створюються спеціальною апаратурою. Електропорація є перспективним методом, оскільки дозволяє вводити ДНК клітин мікроорганізмів, для яких системи трансформації невідомі або здійснюються з низькою ефективністю.
Для різних мікроорганізмів, у яких описано процес трансформації, розроблено свої методи одержання компетентних клітин та їх трансформації. У цьому посібнику ми наводимо методику приготування компетентних клітин Е. coli штаму С600 та їх трансформації плазмідними ДНК з високою ефективністю.
Виділення плазмідної ДНК із клітин Е. coli. Є велика кількість методів виділення препаратів плазмідної ДНК, придатної без її подальшого очищення для трансформації клітин Е. coll. Одним з найпоширеніших методів є метод виділення плазмідних ДНК за допомогою лізису клітин кип'ятінням (Holmes, Quigley, 1981). Нижче наводиться вказаний метод у дещо модифікованому варіанті.
Клітини з нічної культури Е. coli (1,5-5 мл) беруть в облогу центрифугуванням при 11 тис. об/хв протягом 3 хв в пробірках Еппендорф, Супернатант ретельно зливають, а осад ресуспендують для лізису в 350 мкл STET-буфера (8% -на сахароза, 5'%-ний тритон Х-100, 50 мМ ЕДТА-Na *, 50 мМ трис-HCl; рН 8,0). Додають 25 мклрозчину лізоциму у дистильованій воді (10 мг/мл), перемішують та інкубують суміш при кімнатній температурі протягом 5 хв. Пробірки переносять у киплячу водяну баню та інкубують протягом 40 с. Потім отримані лізати центрифугують при 11 тис. об/хв протягом 30 хв і осад (лізовані клітини, денатуровані білки і денатурована хромосомна ДНК) видаляють чистою сірником або переносять супернатант в чисту пробірку, В пробірку додають 174 мкл 7,5 М амонію та 300 мкл ізопропілового спирту, перемішують та інкубують при -20° протягом 15 хв. У умовах відбувається преципітація ДНК, тоді як неденатуровані білки залишаються у розчині. Преципітату осаджують центрифугуванням при 11 тис. об/хв протягом 15 хв. Осад двічі промивають 1,5 мл7(\%-ного етанолу, охолодженого до -20° (етанол слід акуратно додавати в пробірку, не перемішуючи осаду; центрифугування проводять, як зазначено вище, протягом 10 хв). Отриманий осад (білуватий наліт на дні пробірки) висушують струменем повітря (можна використовувати фен) і розчиняють у 50 мкл ТЕ-бу-фера (10 мМ трис-НС1, 1 мМ ЕДТА-№2, рН7,5).