Біосинтез лізину
Лізин (а, е-діамінокапронова кислота) відомий у вигляді двох оптично активних D-і L-форм та рацемічної DL-форми. Емпірична формула C6H12N2O2. Молекулярна вага 146,19. Лізин добре розчинний у воді, кислотах, основах; важко розчинний у спирті і нерозчинний в ефірі. Амінокислота при температурі 224-225 ° С розкладається. Кристалізується лізин у вигляді безбарвних голок чи гексагональних платівок.
Встановлено, що у організмі лізин визначає як біологічну цінність білка. Амінокислота виконує багато інших біохімічних функцій - вона сприяє секреції травних ферментів і транспорту кальцію в клітини, покращує загальний азотний баланс в організмі. Застосування лізину в хлібопекарській промисловості підвищує біологічну цінність та покращує якість виробів. Від додавання лізину до раціонів тварин (0,1-0,4%) значно збільшується коефіцієнт використання білка, і тим самим знижується витрата кормів на одиницю продукції.
Біосинтез лізину
Він здійснюється за допомогою ауксотрофних мутантів мікроорганізмів роду Micrococcus, Brevibacterium, Corynebacterium та ін. Поживні середовища, що використовуються для вирощування мікроорганізмів і біосинтезу амінокислоти, містять як джерело вуглеводів бурякову мелясу, кукурудзяний екстракт або білків. Джерелами азоту можуть бути солі амонію, сечовина. При біосинтезі лізину важливу роль відіграє концентрація факторів зростання в середовищі – біотину та необхідних амінокислот – метіоніну, гомосерину, треоніну. Для росту та біосинтезу лізину культурою Brevibacterium sp. 22 оптимальною вважається наступна концентрація на 1 л живильного середовища: метіоніну 200 мг, треоніну 800 мг, біотину 15-20 мкг. При зменшенні концентрації біотину (на 1 л) до 1-4 мкгкультура Brevibacterium sp. 22 синтезує глутамінову кислоту, при збільшенні до 2,5 мг утворюється молочна кислота - явище, відоме механізм зворотної дії.
Біосинтез лізину мікроорганізмами (діамінопімеліновий шлях) починається з аспарагінової кислоти та проходить через діамінопімелінову кислоту. Один шлях біосинтетичних перетворень аспарагінової кислоти призводить до синтезу лізину, інший – синтезу гомосерину. Гомосерин – проміжний продукт для синтезу треоніну та ізолейцину, з одного боку, та метіоніну – з іншого. При порушенні біосинтезу треоніну, метіоніну та ізолейцину на стадії утворення гомосерину перебіг реакцій перетворення аспарагінової кислоти зрушується у бік утворення лізину.
Слід зазначити, що у синтезі лізину ключовим ферментом є аспартаткиназа. При синтезі лізину підвищені концентрації треоніну пригнічують аспартаткиназу. Цей ефект посилює присутність лізину. Треонін у бактерій (Е. coli, Micrococcus glutamicus) інгібує дегідрогеназу напівальдегіду аспарагінової кислоти та гомосериндегідрогеназу. Метіонін по відношенню до гомосериндегідрогенази є репресором. Треоніндегідрогеназу інгібує ізолейцин. Таким чином, продукти обміну речовин, що пригнічують різні ферменти та беруть участь у синтезі лізину, мають бути виведені з реакції. Саме тому ауксотрофні мікроорганізми є найзручнішими для виробництва. Наприклад, культура, позбавлена активності гомосериндегідрогенази, забезпечує досить високі виходи лізину.
На рис. 5.1 наведено схему біосинтезу лізину в бактеріальних клітинах, на якій показані проміжні метаболіти, що синтезуються по загальному з лізином шляху з аспарагінової кислоти.
Технологічні схеми виробництва L-лізину.Технологіяотримання кристалічного L-лізину, розроблена Всесоюзним науково-дослідним інститутом генетики та селекції промислових мікроорганізмів, складається з двох основних стадій: культивування продуцента та виділення кінцевого продукту. На стадії культивування проводиться двоступінчасте вирощування посівної культури Micrococcus glutamicus в інокуляторах та посівних апаратах. Попередньо вираженою культурою засівається ферментатор, в якому в стерильних аеробних умовах при безперервному перемішуванні та термостатуванні (30-33 ° С) здійснюється біосинтез. При ферментації протягом 50-70 год при pH 7,4 концентрація лізину у розчині досягає 40 г/л.
Отримана після біосинтезу культуральна рідина прямує на освітлення, у результаті відокремлюється біомаса. Осад відокремлюють фільтрацією, сушать, розмелюють і використовують як кормовий продукт, що містить близько 40% білкових речовин.
Для тваринництва Інститутом біохімії ім. А. Баха АН СРСР разом із Інститутом мікробіології ім. А. Кірхенштейна АН Латвійської РСР на Ліванському дослідному біохімічному заводі було налагоджено виробництво кормового концентрату лізину – ККЛ (рис. 5.2).
Технологічний процес отримання ККЛ включає такі основні виробничі стадії: вирощування посівного матеріалу та приготування живильного середовища, виробниче культивування, випарювання та сушіння культуральної рідини, фасування та пакування готового продукту.
Культура Brevibacterium sp. 22 являє собою грампозитивні нерухомі бактерії, що мають форму клітин від овальних до коків. Продуцент лізину - ауксотроф - потребує біотину, тіаміну, треоніну та метіоніну. Вихідну культуру розмножують на агаризованому середовищі (2% м'ясопептонний агар) і культивують при 29-30 °С.Раз на два місяці культуру розсіюють на агаризовані середовища. Активність колоній, що виросли, перевіряють на рідкому живильному середовищі наступного складу (в %): меляса 3-5, кукурудзяний екстракт 2,5-3,5, хлорид натрію 0,3. pH середовища доводиться до 7-7,2 додаванням 20% розчину гідроксиду натрію. Частину активних колоній висушують (ліофілізують), а частину пересівають на м'ясопептонний агар. Вирослі культури служать як вихідні для виробництва лізину. Перевірений активність посівний матеріал вирощують на мелассно-кукурудзяному середовищі в колбах (на 750 мл) протягом 24 год при pH 6,9-7,0 і температурі 29-30 °С. Посівний матеріал характеризується титром клітин 2,0*10 8 ступеня в 1 мл середовища. Для вирощування культури-продуцента в посівному апараті готують середовище наступного складу (%):
Середовище стерилізують 1 годину при температурі 126 °С. У посівний ферментатор на 250 л вносять 3-5% від обсягу середовища посівного матеріалу. Коефіцієнт заповнення посівного апарату дорівнює 0,5. Культуру вирощують при 29-30 °С, безперервної аерації (1 об'єм на 1 об'єм середовища за хвилину) і перемішуванні (мішалка турбінного типу, 300 об/хв) протягом 24 год. простерилізованого (протягом 1 години при температурі 120 °С) кашалотового жиру.
Виробниче культивування продуцента.Виробниче культивування здійснюється у ферментаторах місткістю 50 і 100 м3. До засіву посівним матеріалом ферментатор промивається та стерилізується протягом 1 години при 0,1 МПа. Культура вирощується на середовищі наступного складу (у%):
Поживне середовище стерилізується при температурі 130-132 ° С протягом 10-15 хв. Після охолодження до 30-32 ° С середу подають ферментатор. По стерильній посівній лінії ферментатор надходить посівнийматеріал у кількості 5-6% від обсягу живильного середовища. Коефіцієнт заповнення ферментатора становить 0,75. Процес ферментації триває 48-72 год при температурі 29-30 °С, безперервному перемішуванні та аерації середовища стерильним нагрітим повітрям (до 50 °С) з розрахунку 1 об'єм на 1 об'єм середовища за хвилину при надмірному тиску повітря у ферментаторі 20-30 кГТа. Піногасіння здійснюється стерильним кашалотовим жиром, що подається з мірника піногасника. Загальна витрата піногасника становить 0,5% обсягу середовища, причому 0,2% піногасника вносять в момент приготування живильного середовища.
Випарювання та сушіння культуральної рідини.Стабілізована 0,15%-ним бісульфітом натрію культуральна рідина з pH 5,0-6,0 випаровується на вакуум-випарній установці. Початкова концентрація сухих речовин у рідині, що надходить на випарювання, становить 10-15%, кінцева – близько 40%. Випарена культуральна рідина висушується нагрітим повітрям на розпилювальній сушарці з дисковим розпилювачем при 300/90 °С.
Фасовка та упаковка готового продукту.Висушений до залишкової вологості 4-8% ККЛ фасується по 20 кг у крафт-мішки з поліетиленовим вкладишем. При правильному дотриманні технологічного режиму вихід лізину на стадії ферментації становить 23-26% від вмісту засвоєного цукру, а культуральної рідини накопичується до 20-25 г/л L-лізину. Загальні втрати лізину на стадії випарювання та сушіння не перевищують 15%.
Сухий концентрат кормового лізину, що отримується висушуванням стабілізованої та сконцентрованої рідини, має суттєвий недолік. Він дуже гігроскопічний і при зберіганні злежується великими грудками. Гігроскопічність препарату може бути знижена в результаті дображивания залишкових цукрів спеціальною культурою дріжджів або додаваннямпроцесі сушіння ККЛ кісткового борошна, бентоніту, аеросилу. Один з варіантів одержання сухого препарату ККЛ полягає в тому, що рідкий концентрат лізину змішується з пшеничними висівками до отримання суміші вологістю близько 70% після гранулювання висушується на конвективних сушарках. Готовий препарат ККЛ містить до 7-10% лізину, він сипкий і негігроскопічний.
Відповідно до ТУ 59-72-74 сухий ККЛ повинен містити монохлоргідрат L-лізину в перерахунку на суху речовину не менше 10% і мати вологість не більше 10%. Хімічний склад сухої речовини концентрату лізину наведено нижче.
Комбінований, або ензиматичний, спосіб виробництва лізину
Японська фірма "Тойо Рейон" ("Торей") запропонувала в 1973 р. принципово новий спосіб отримання L-лізину, перевага якого полягає в тому, що кінцевий продукт відрізняється високою концентрацією та чистотою. У результаті реакції немає небезпеки зараження сторонньої мікрофлорою. Відпадає необхідність поділу амінокислоти на оптичні ізомери. Можливе створення безперервного процесу з використанням спільної дії іммобілізованих ферментів в одному реакторі.
Процес складається із стадій органічного синтезу та ферментативного гідролізу. Вихідною сировиною для отримання цієї амінокислоти є циклогексан. В результаті хімічних реакцій з циклогексану виходить циклічний ангідрид лізину (DL-a-аміно-е-капролактам), який на стадії ферментативного гідролізу перетворюється на L-лізин.
При цьому виробляють поділ оптичних ізомерів, що є складним та дорогим процесом при синтезі не тільки L-лізину, а й інших амінокислот. Розподіл оптичних ізомерів DL-а-аміно-е-капролактаму здійснюється при використанні мікробних ферментів. При цьому відбуваєтьсяасиметричний гідроліз за допомогою гідролази амінокапролактаму з утворенням L-лізину
Схема отримання L-лізину, розроблена фірмою "Торей", представлена нижче.
Крім лізину в реакційній суміші міститься D-a-аміно-e-капролактам, який з метою збільшення виходу L-лізину піддають рацемізації. Для виявлення переваги аналізованого процесу необхідно, щоб одночасно з гідролазою L-a-аміно-е-капролактаму діяв фермент, що рацемізує D-a-аміно-е-капролактам. Тільки спільна дія цих двох ферментів забезпечує перетворення DL-а-аміно-е-капролактаму на L-лізин майже зі 100%-ним виходом. Вміст амінокислоти реакційної суміші може досягати 200 г/л.
Встановлено, що здатність синтезувати гідролазу L-a-аміно-е-капролактаму мають дріжджі пологів Cryptococcus, Candida, Trichosporon. Активаторами цього ферменту є іони Mn2+, Mg2+, Zn2+, інгібітором - етилендіамінтетраоцтова кислота. Фермент рацемазу а-аміно-е-капролактаму отримують при вирощуванні бактерій, що належать до пологів Achromobacter, Flavobacterium та ін. Інгібуючу дію на цей фермент має гідроксиламін. Принцип дії рацемази а-аміно-е-капролактаму, мабуть, такий же, як і рацемаз інших амінокислот, що вимагають як кофактор піридоксаль-5-фосфат.
Спільна дія двох ферментів на субстрат досягається введенням у водний розчин DL-амінокапролактаму певної кількості біомаси або сухих клітин дріжджів, що мають гідролазну активність, і бактерій з рацемазною активністю амінокапролактаму. В результаті реакції DL-амінокапролактам кількісно перетворюється на L-лізин. Оптична чистота одержуваної амінокислоти понад 99%.
Новий спосіб отримання лізину цікавий ще й тим, що L-гідролазу та рацемазуамінокапролактаму можна отримувати в іммобілізованій формі, що дає великі переваги в порівнянні з використанням розчинних ферментів. Для цього розчин DL-амінокапролактаму, отриманий хімічним способом, пропускають через колонку, що містить два іммобілізовані ферменти мікробного походження. Перший гідролізує амідний зв'язок в L-амінокапролактамі, не торкаючись D-ізомеру, другий фермент - рацемаза - з високою швидкістю перетворює D-ізомер на рацемат. За правильно підібраних умов та режиму роботи колонки єдиним продуктом процесу є L-лізин, його вихід становить 95%.