Експериментальне вивчення противірусної активності Інгавірину щодо аденовірусу людини
Ст.
Вивчено противірусні властивості препарату Інгавірін щодо респіраторного вірусу людини — аденовірусу 5 типу при використанні культури клітин НЕр-2. При концентрації Інгавірину 1000, 100 і 10 мкг/мл формується вірусне потомство зі зниженою інфекційною здатністю (250, 100 і 10 разів відповідно). Електронно-мікроскопічний аналіз інфікованих клітин підтвердив здатність Інгавірину порушувати нормальний морфогенез аденовірусу.Ключові слова: Інгавірін, аденовірус людини 5 типу, противірусна активність, електронно-мікроскопічний аналіз, культура клітин Нер-2.
Experimental Study of Ingavirin ® Antiviral Activity Against Human Adenovirus
V. V. Zarubaev, A. V. Slita, A. K. Sirotkin, V. E. Nebolsin, O. I. Kiselev Research Institute of Influenza, North-West Branch of Russian Academy of Medical Sciences, St.Petersburg Valenta Farm, Moscow
Введение Незважаючи на успіхи в галузі вакцинації, хіміопрофілактики та хіміотерапії респіраторних вірусних інфекцій людини, ці захворювання, як і раніше, займають провідне місце в структурі інфекційної патології людини. Крім грипу, істотну частку респіраторних інфекцій становлять захворювання, спричинені вірусами інших сімейств: корона-, адено- та параміксовірусами (респіраторно-синцитіальний вірус та вірус парагрипу). У етіологічній структурі гострих респіраторних вірусних захворювань (ГРВЗ) аденовіруси людини займають значну позицію. Аденовірусні захворювання (АВЗ) поширені повсюдно і реєструються протягом усього року з підйомом у зимово-весняний період, викликаючи фарингіти, ріно - фаринготонзиліти, фарингокон'юнктивальну лихоманку,епідемічний керато-кон'юнктивіт, бронхіти та пневмонію. Окремі випадки, нозокоміальні та локальні спалахи захворювання часто спостерігаються у закритих дитячих та дорослих колективах. АВЗ викликаються великою групою аденовірусів, з яких в патології людини найбільше значення мають типи 3, 4, 5, 7, 8, 14, 21. викликає ОРВЗ у дорослих.
Активність щодо аденовірусу була показана in vitro для аналогів нуклеотидів [1, 2]. Рибавірин, що використовується для терапії РС-вірусної інфекції, виявився ефективним [3, 4], частково ефективним [5] або не мав ефективності [6, 7] щодо аденовірусної інфекції. Препарат Ганцикловір, ефективний при цитомегаловірусній інфекції, виявляє ефективність щодо аденовірусу як in vitro, так і in vivo [8, 9]. На основі (S)-1-(3-гідрокси-2-фосфонілметоксипропіл) цитозину компанією Gilead Sciences був розроблений препарат Цидофовір з широким спектром противірусної активності [10-15]. Рибавірин, ганцикловір та цидофовір були з більшим або меншим успіхом використані для терапії аденовірусних патологій людини, включаючи гепатити, цистити та пневмонії при імунодефіцитних станах у реципієнтів органів [3, 4, 6, 9]. При цьому виражені побічні дії та здатність аденовірусу до формування стійких штамів обмежують використання цих препаратів [13, 16, 17].
Ряд сполук інших класів, таких як ліпіди [18], акридони [19], імідазохінолінаміни [20], як і інші аналоги нуклеозидів [1, 2, 21-24] також виявляють антиаденовірусну активність. Зростання вірусу в клітинній культурі може бути пригнічений катехінами зеленого чаю, хоча і у високих концентраціях [25].
Препарати інтерферону, які застосовуються для лікування респіраторних інфекцій, ефективні в основному при профілактичному застосуванні і не можуть вважатися основним засобом терапії при важких випадках інфекції. Аденовіруси мають ефективні механізми придушення інтерферон-індукованого противірусного каскаду реакцій, внаслідок чого стійкі до дії інтерферону та його індукторів [26].
Таким чином, дуже актуальною є проблема пошуку та розробки нових противірусних препаратів, що не мають побічних ефектів і можливо більш широкого спектра дії, включаючи ефективність щодо аденовірусу. Раніше була показана активність препарату Інгавірін (2-(імідазол-4-іл) етанамід пентандіової-1,5 кислоти) щодо вірусу грипу. Інгавірін є низькомолекулярним аналогом ендогенного пептидоаміну, що виділяється з морського молюска Aplysia californica. Як у дослідах in vitro [27], так і in vivo на моделі грипозної інфекції [28] було показано, що препарат здатний обмежувати реплікацію вірусу в культурі клітин, а також має високу протективну активність при експериментальному грипі у мишей.
Мета цього дослідження – оцінка противірусних властивостей препарату Інгавірін щодо іншого респіраторного вірусу людини – аденовірусу 5 типу.
Матеріал та методи Препарати. У роботі використовували субстанцію препарату Інгавірін у вигляді білого кристалічного порошку. Аліквоти препарату розводили серед клітинних культур Голка MEM (БіолоТ, Санкт-Петербург, кат.# 1.3.3).
Віруси та клітини. У роботі використали аденовірус людини 5 типу з колекції вірусних штамів НДІ грипу. Вірус культивували у клітинах HEp-2.
Вивчення противірусної активності препаратів. Для вивчення інфекційностівірусного потомства клітини інкубували з досліджуваним препаратом протягом 1 год, після чого в культуральну рідину додавали вірус (1000 CTD50 на клітину) і інкубували протягом 1 години. у тих самих концентраціях. Вірус культивували протягом 24 год, клітини зіскабливали з лунок і титрували інфекційність вірусного потомства. Для цього з вмісту виукраїна готували серію десятикратних розведень від 10 -1 до 10 -6 на середовищі MEM. Заражені клітини культивували при 37°С в атмосфері 5% СО2 у газопроточному інкубаторі Sanyo-175. Термін культивування становив 72 години, після чого клітини використовували для мікротетразолієвого тесту (див. нижче).
Кількість життєздатних клітин оцінювали за допомогою мікротетразолієвого тесту. Для цього клітини промивали 2 рази по 5 хв фосфатно-сольовим буфером, і до лунок планшетів додавали по 100 мкл розчину (0,5 мг/мл) 3-(4,5-диметилтіазоліл-2) 2,5-дифенілтетразолію броміду (ICN Biochemicals Inc., Aurora, Ohio) на фізіологічному розчині. Клітини інкубували при 37°З атмосфері 5% СО2 протягом 2 год і промивали протягом 5 хв фосфатно-сольовим буфером. Осад розчиняли 100 мкл на лунку ДМСО, після чого оптичну щільність в лунках планшетів вимірювали на багатофункціональному рідері Victor 1420 (Perkin Elmer, Finland) при довжині хвилі 535 нм. За результатами тесту оцінювали частку загиблих клітин у контрольних лунках та лунках із препаратами.
Електронно-мікроскопічні дослідження. Досвідчені культури обробляли Інгавірином у концентрації 1000 мкг/мл за 1 год до зараження вірусом (1000 CTD50 на клітину). Через 18 і 36 год після зараження контрольні та дослідні культури клітин фіксували 1,5% розчином глутаральдегіду на середовищіDMEM (рН 7,2), центрифугували 20 хв при 2000 об/хв і фіксували 2,5% розчином OSO4. Клітини зневоднювали ацетоном у зростаючій концентрації і заливали суміш епон/аралдит. Ультратонкі зрізи, отримані на ультрамікротомі Ultracut (Reichert, Austria), контрастували уранілацетатом та цитратом свинцю та переглядали на електронному мікроскопі JEM-100S (JEOL, Japan) при інструментальному збільшенні 5000-50000. Фотозйомку проводили на плівку ФТ-4ШД.
Статистична обробка даних. Статистичну обробку результатів (розрахунок середніх значень та стандартних відхилень, а також розрахунок 50% ефективних доз за допомогою лінійної регресії) проводили за допомогою програми Microsoft Excel. Достовірність відмінностей оцінювали за критерієм Стьюдента. Достовірними вважали різницю між групами, якщо параметр «р» вбирається у 0,05.
Результати та обговорення Вплив Інгавіріна на реплікацію аденовірусу в культурі клітин. У проведених експериментах було оцінено вплив Інгавіріна на інфекційність вірусної популяції, сформованої в клітинах. З цією метою вірус культивували протягом 24 годин у присутності Інгавірину в різних концентраціях, після чого проводили титрування інфекційності вірусного потомства у другому пасажі. Дані щодо впливу Інгавіріна на інфекційність аденовірусу наведені в табл. 1.
Таблиця 1.
Реплікація аденовірусу у клітинах HEp-2 у присутності Інгавірину ®
Як випливає з представлених даних, культивування аденовірусу в присутності Інгавіріну ® призводило до формування вірусного потомства, що має знижену інфекційну активність. Ступінь придушення цієї активності безпосередньо залежала від використаної концентрації препарату, і при концентрації Інгавірину ® 1000, 100 та 10 мкг/мл становила2,4; 2,0 та 1,0 порядку (250, 100 та 10 разів) відповідно.
Ультраструктурні дослідження. Як було показано під час ультраструктурних досліджень, клітини HEp-2, інфіковані Ad5, через 18 годин після інфікування були збільшені у розмірах. Клітинні органели у цитоплазмі виглядали інтактними. У самій цитоплазмі починалися вакуолізаційні процеси, типові для цитодеструктивної дії аденовірусу. Ядерний хроматин розташовувався вздовж внутрішнього шару ядерної мембрани, у каріоплазмі спостерігалося формування специфічних аденовірусних включень, що знаходяться на ранніх стадіях розвитку. У складі включень виразно розрізнялися центральні зони помірної електронної щільності, зони міжхроматинових гранул, що мають дрібноглибкувату гранульовану структуру, і компактно-електроннощільні кільця по периферії включень (рис. 1). У ядрах клітин відзначалися віріони характерної ікосаедричні форми.
У клітинах, інфікованих аденовірусом у присутності Інгавіріна, ознаки ранніх стадій вірусної реплікації були подібними до таких у клітинах контрольної культури, не відрізняючись від них ні якісно, ні кількісно. Як і в контрольних клітинах, у каріоплазмі спостерігалося формування специфічних аденовірусних включень, в яких чітко розрізнялися центральні зони помірної електронної щільності, зони міжхроматинових гранул та електроннощільні компактні кільця по периферії включень (рис. 2). У ядрах клітин відзначалися нечисленні віріони аденовірусу.
Таким чином, морфогенез власне аденовірусної інфекції в присутності Інгавірину не відрізнявся принципово від контрольних показників. Для більш повної характеристики репродукції вірусу було проведено підрахунок кількості віріонів у перерахунку одну клітину, і навіть підрахована частка морфологічно неповноцінних вірусних частинок (табл. 2).
Таблиця 2.
Морфологічний склад популяції аденовірусу людини 5 типу, що сформувалася в умовах застосування Інгавірину ®
Ті ж тенденції зберігалися і на пізнішому терміні після інфікування (36 год). Кількість вірусних частинок у ядрах клітин багаторазово зростала, і його підрахунок, враховуючи виражену цитодеструктивну дію вірусу на цій стадії, не відображав адекватно динаміку вірусної репродукції. Якісно склад вірусної популяції цієї стадії представлений на рис. 3. На малюнку видно, що застосування Інгавірину істотно підвищує частку незрілих віріонів, що не містять серцевини (рис. 3).
Отримані результати можна трактувати, як здатність Інгавіріна ® впливати прямо чи опосередковано, на процеси упаковки вірусного геному в капсиди [29-31].
В цілому отримані дані дозволяють говорити про наявність у Інгавіріну ефективного механізму захисту клітин від аденовірусної інфекції, що полягає в здатності порушувати нормальний морфогенез аденовірусу, знижуючи тим самим інфекційність вірусного потомства.