Генетична інженерія
Великий інформаційний архів
Внаслідок бурхливого розвитку молекулярної біології та молекулярної генетики, розширення експериментальних можливостей маніпулювання з генетичним матеріалом з'явилася можливість такого експериментального втручання, яке дозволяє здійснювати спрямовану зміну геному, не вдаючись до традиційних методів схрещування чи викликання мутацій. Народився новий напрямок — генетична інженерія, завдання якої полягає в отриманні індивідуальних генів або ізольованих генетичних структур і введенні їх у нове генетичне оточення з метою створення організмів з новими, заздалегідь зумовленими ознаками. Іншими словами, завдання генетичної інженерії полягає не у зміні вже наявних у клітині генів, а у введенні в них нових, відсутні раніше генів.
Існує кілька способів отримання окремих генів або їх об'єднань:
1) контрольована фрагментація геному, поділ фрагментів та їх ідентифікація;
2) виділення індивідуальних оперонів з трансдукуючих фагів, що містять однакові бактеріальні гени;
3) хімічний синтез;
4) біохімічний (ферментативний) синтез.
Отримання генів за допомогою контрольованої фрагментації геному найбільше застосування отримало в експериментах з виділення бактеріальних генів завдяки тому, що окремі фрагменти ДНК можна ідентифікувати в дослідах генетичної трансформації. Фрагментацію геному проводять або механічно, або за допомогою спеціальних ферментів - рестрикційний ендонуклеаз. Відомо безліч цих ферментів, але кожен з них має велику специфічність до відомої їм послідовності нуклеотидів у молекулі ДНК. Такі ферменти дізнаються послідовності довжиною 4 і 6 пар нуклеотидів ірозрізають молекулу в цьому місці, залишаючи кінці або тупими, або з невеликими в 3-4 нуклеотиди, однонитковими ділянками («липкими кінцями»). Оскільки такі послідовності можуть бути в будь-якій за походженням ДНК, очевидно, що характер розрізання, «рестрикції» різних ДНК буде однаковий. При рестрикції або механічному дробленні ДНК ген може бути структурно порушеним. Тому цілісність його обов'язково слід перевірити за наявності функції у досвіді трансформації. Якщо функція гена збережена, приступають до його виділення та подальшого використання. Необхідно відзначити, що одержувані таким чином фрагменти ДНК часто можуть містити кілька довколишніх генів замість одного шуканого, проте навіть таке збагачення по одному гену можна вважати успіхом.
Виділення індивідуальних оперонів з трансдукуючих бактеріофагів описано Дж. Беквітсом, який використовував два різні бактеріофаги кишкової палички, що несуть лактозний оперон цієї бактерії. Оскільки фаги різні, то природно, послідовність основ у молекулах їх ДНК різна і єдиною загальною ділянкою в обох фагів є бактеріальний оперон. Грунтуючись на цьому, із взятих фагів було виділено ДНК, потім розділили її нитки та змішали ідентичні нитки ДНК двох фагів. Оскільки гомологічними були послідовності тільки в області лактозного оперону, то саме в цій галузі пройшла гібридизація з утворенням двониткової структури, решта ділянок фагового геному залишилася незгібридизованою, їх прибрали спеціальною нуклеазою, що гідролізує однониткову ДНК. Таким чином, був отриманий у чистому вигляді бактеріальний оперон з регуляторними областями та всіма структурними генами. Даний метод застосовується і для інших оперонів за наявності відповідних трансдукуючих бактеріофагів. Щоправда,отримання таких фагів є досить важким, але цілком вирішуваним завданням.
Хімічний синтез гена розроблений індійським ученим Хоран, ним же синтезований перший ген. Це був ген аланінової тРНК дріжджів, що складається всього з 77 пар нуклеотидів. Зрозуміло, синтезувати таким чином можна такий ген, послідовність нуклеотидів в якому вже визначена, або ж яку можна скласти з послідовності амінокислот в молекулі білка синтезованого цим геном, якщо така послідовність відома. Десять років знадобилося лабораторії Хорани, щоб синтезувати функціонально активний ген. також виявився ген транспортної РНК - супресорної тирозинової тРНК кишкової палички, його структурна частина складається з 126 пар нуклеотидів. кілька генів транспортних РНК, ген-оператор лактозного оперону кишкової палички, гени деяких пептидних гормонів.
Біохімічний, або ферментативний синтез генів став можливий після відкриття ферменту РНК-залежної ДНК-полімерази, здатного синтезувати молекули однониткової ДНК, використовуючи в якості матриці молекули мРНК. Оскільки такий фермент може вести синтез тільки з двоспіральної дільничної молекули мРНК, як відомо, мають на одному з кінців поліА-послідовність, то безклітинну систему з чотирма нуклеотидтрифосфатами, мРНК і ферментом додають затравку у вигляді полімідилової кислоти. Остання створює двониткову структуру з полиАтпоследовательностью, що забезпечує початок роботи ферменту. РНК-залежна ДНК-полімераза синтезує одну з ниток, на якій потім за допомогою ДНК-залежної ДНК-полімерази можнасинтезувати другу нитку ДНК. Ферментативним шляхом в даний час синтезовано багато генів, у тому числі гени глобіну (білкової частини гемоглобіну) миші, щура, кролика, людини, курки, гени інсуліну риби та людини, гени окремих ланцюгів імуноглобуліну (білка, що забезпечує імунні реакції організму), людського інтерферону , Гени запасних білків кукурудзи (зеїну), сої (гліциніна), гороху (легуміну), квасолі (фазеоліну) та ін.
Наслідуючи друге завдання генної інженерії, отримані одним з описаних методів гени необхідно ввести в клітини, в яких цих генів раніше не було. Для більшої ефективності введення в клітини чужорідних генів використовують спеціальні молекули, названі векторами, які ці гени вбудовують. Молекули ДНК, які претендують на роль векторів, повинні відповідати наступним основним вимогам: 1) невеликі розміри; 2) велика кількість копій на клітину; 3) простота виділення; 4) наявність унікальних (поодиноких) сайтів рестрикції для кількох ендонуклеаз; 5) наявність селективних маркерів для відбору трансформантів. Найбільшою мірою цим вимогам відповідають деякі бактеріальні плазміди, а також спеціальні мутанти деяких помірних фагів.
Для введення синтезованого будь-яким способом гена, фрагмента ДНК, отриманого шляхом механічного дроблення ДНК, або гена, виділеного за Беквітсом, вектор розрізається однією з ендонуклеаз з унікальним сайтом, рестрикції, потім до вектора і гена пришиваються за допомогою ферменту кінцевої трансферази комплементарні гомополімерні послідовності (наприклад, поліА та поліТ або поліЦ та поліГ). Отримані компоненти змішують, обробляють полінуклеотидлігазою та створеною таким чином молекулою рекомбінантної ДНК трансформують реципієнтні клітини. Для введення у вектор гена або фрагментаДНК, отриманого в результаті рестрикційного фрагментування геному, вектор обробляють тією ж ендонуклеазою, що і донорну ДНК, потім продукти змішують один з одним, обробляють полінуклеотидлігаз і трансформують реципієнтні клітини. Відбір трансформантів проводять або за вбудованим геном, якщо він може служити генетичним маркером, або за тим та іншим. Трансформанти, що виросли при цьому, називають клонами, а саму процедуру часто називають молекулярним клонуванням ДНК. Звичайно, техніка молекулярного клонування найбільш повно розроблена поки що для бактерій і небагатьох. Основними моделями генетичної інженерії в даний час є кишкова та сінна палички. Поступово до них починають долучатися деякі інші бактерії та дріжджі, а також клітини рослин та ссавців у культурі. Причин відставання багатоклітинних організмів багато: і складніша їх організація, і менша вивченість, й у з цим відсутність надійних векторів запровадження генів. Одним із кандидатів у вектори для клітин людини вважається мавповий вакуолізуючий вірус 40 (ОВ40), на якому вже проводяться успішні роботи з клонування ДНК. Кандидатами у вектори для рослин вважають плазміду, що викликає корончасті галли у рослин, а також ДНК-вірус мозаїки цвітної капусти.
Однак перенесення генів можливе і безвекторним способом. Зокрема, цікаві дані, отримані в результаті злиття протопластів (клітин, позбавлених оболонок) різних видів рослин. Внаслідок такого злиття відбувається повне поєднання генетичного матеріалу обох клітин і не тільки геномного, але і пластомного (що знаходиться у складі пластид, мітохондрій та ін), чого не вдається досягти при звичайному схрещуванні.
Великий інтерес представляють роботи звикористання помірних фагів і деяких вірусів як носії певних генів. Так, бактеріофаги кишкової палички, що несуть лактозний або галактозний оперон, були використані для введення останніх у клітини людини та рослин. Є достатньо підстав вважати, що бактеріальні гени можуть фенотипно виражатися у клітинах багатоклітинних організмів.
Завдання, що стоять перед генетичною інженерією, мають переважно прикладний характер. Їх можна класифікувати так:
1) створення нових рас мікроорганізмів зі зміненою якістю та збільшеною кількістю виробленого ними цінного продукту;
2) клонування в мікроорганізмах ділянок геномів або індивідуальних генів тварин та людини з метою виробництва в мікробній клітині особливо цінних препаратів;
3) клонування в мікроорганізмах генів, що кодують вірусні та мікробні антигени, протипухлинні антигени та інтерферони для забезпечення їх промислового виробництва мікробіологічним шляхом;
4) генетична модифікація вищих рослин для збільшення їх продуктивності та покращення якості створюваних ними продуктів;
5) клонування генів, необхідні виправлення спадкових дефектів людини.
Богданова, Т.Л. Довідник з біології/Т.Л. Богданова [та д.р.]. - К.: Наукова думка, 1985. - 585 с.