ГІСТОЛОГІЧНЕ ОБГРУНТУВАННЯ ЕФЕКТИВНОСТІ ТЕС-ТЕРАПІЇ ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМУ ІШЕМІЧНОМУ ІНСУЛЬТІ -
Транскраніальна електростимуляція (ТЕС-терапія) є вплив електричним струмом на мозок через покриви черепа, що призводить до селективної активації структур, що відносяться до антиноцицептивної системи стовбура мозку [7].
Величезне значення мають дані, що показують нейропротекторний, протизапальний, антиоксидантний, нейротрофічний, антигіпоксичний ефекти активації δ-опіоїдних рецепторів [3].
Враховуючи вищесказане, передбачається позитивний ефект впливу ТЕС-терапії протягом експериментальної моделі ішемічного інсульту (ІІ).
Метою нашого дослідження є вивчення впливу ТЕС-терапії на морфологію вогнища інфаркту мозку у динаміці експериментального ішемічного інсульту.
Матеріали та методи. Дослідження проведено у лабораторії кафедри загальної та клінічної патофізіології. Імуноферментні дослідження (ІФА) проводили на базі ЦНДЛ відділу клінічної експериментальної імунології та молекулярної біології ДБОУ ВПО КубДМУ МОЗ України. Експерименти проведені на 100 білих нелінійних щурах самцях, середньою масою – 200±25 гр. Зміст тварин та постановка експериментів проводилася відповідно до міжнародних правил «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals». Щури були поділені на 4 групи: 1 група - з 20 щурів, контрольна, інтактні тварини; 2 група – із 40 щурів, у яких проводилося моделювання експериментального ішемічного інсульту без проведення ТЕС-терапії; 3 група – з 40 щурів, які після моделювання експериментального ішемічного інсульту проводили 7 сеансів ТЕС-терапії. Усі потенційно болючі втручання у експериментах, а також евтаназія здійснювалися під комбінованим ін'єкційним наркозом: золетил 0,3 мг в/м («Virbac»)Франція), ксиланіт 0,8 мг внутрішньом'язово (ЗАТ «НІТА-ФАРМ», Україна, м. Саратов), атропіну сульфат 0,1% розчин – 0.01 мл п/к з розрахунку на 100 гр. маси тіла тварини [5,7,8].
Моделювання ІІ здійснювали шляхом створення у щурів гострої локальної церебральної ішемії шляхом коагуляції правої середньої мозкової артерії (ПСМА) [5]. ТЕС-терапію експериментальним тваринам з груп №3 здійснювали модифікованим двопрограмним електростимулятором "ТРАНСАІР-03" (ТОВ "Центр транскраніальної електростимуляції", м. Санкт-Петербург) в анальгетичному режимі [3]. Евтаназію щурів виконували з дотриманням правил проведення робіт під час використання експериментальних тварин, шляхом декапітації під стандартним наркозом [2,4]. Для забору тканин головного мозку щури з 2 та 3 груп на 1, 3, 7 та 14 виводилися з експерименту по 10 тварин. Далі проводили вилучення ГМ. Надалі забраний від половини особин в 1 групі, а в групах 2 і 3 (після евтаназії на 1 і 3 добу) ГМ піддавався дворазовому промиванню в охолодженому розчині 0,9% хлориду натрію, з подальшим його заморожуванням і зберіганням при температурі. Розмір осередку церебральної ішемії визначали тетразолієвим методом на макрозрізах [6]. Показник "питомий обсяг інфаркту мозку" визначали як співвідношення обсягу вогнища інфаркту мозку до обсягу всього мозку [1].
Зразки ГМ, що залишилися, піддавалися фіксації в 10% нейтральному формаліні, потім слідувало виготовлення гістологічних мікропрепаратів за класичною технологією через заливання в парафін та їх фарбування гематоксиліном - еозином, по Нісслю, а також гістохімічне дослідження по Чіаччіо [4].
Статистичну обробку отриманих даних здійснювали методами непараметричної статистики з використанням програмного забезпечення "Statistika 6.0 for Windows" фірми "StatSoft Inc.».
Отримані результати досліджуваних груп після статистичної обробки виражали у вигляді середніх значень (M) та середньої помилки (m). Порівняння вибірок проводилося за непараметричним критерієм Манна-Уітні, із встановленням рівня значущості *p≤0,05. Величини середніх значень у таблицях вказані у межах M±m.
Результати дослідження та їх обговорення. Результати проведених морфологічних досліджень тканини ГМ показали, що як на мікропрепаратах, так і на макрозрізах, отриманих від щурів з 1 групи (контрольна), видно будову інтактної тканини ГМ.
При вивченні зрізів тканини мозку щурів 2 групи, зроблених на 1 добу після моделювання ІІ виявлено формування вираженої зони інфаркту мозку, локалізованої переважно в неокортекс із захопленням невеликої ділянки каудопутамена, розташованого в зоні кровопостачання ПСМА. У осередку ішемії спостерігалася гіпохромія ядер клітин, що відбивало процеси деполімеризації ДНК у некротизованих клітинах. Виявляли ознаки перицелюлярного набряку тканини мозку. У центрі області ішемії капіляри запустіли та ставали непомітними на загальному тлі. На периферії вогнища некрозу мозкової тканини розвивалася клітинна відповідь.
Малюнок 1. Зріз тканини мозку щура групи 2. Ув. про. 40. Забарвлення гематоксилін-еозин.
Малюнок 2. Зріз тканини мозку щура групи 2. Ув. про. 40. Забарвлення за Нісслем.
Всі ці ознаки свідчили про появу некрозу нейронів, порушення кровопостачання в зоні інфаркту, що утворюється. Крім того, були ознаки розвитку місцевої запальної реакції.
На 3 добу після моделювання ІІ чітко контурувалася зона інфаркту мозку (рис. 1.1). Значно збільшилася кількість загиблих нейронів (рис. 1.3). Посилився періцелюлярний набряк.З'явилася виражена запальна клітинна інфільтрація (рис. 1.2).
При забарвленні за Нісслем на 3 добу було видно дистрофічно змінені нейрони (рис. 1.1), відзначаються ознаки нейронофагії (рис. 1.2) та виражена запальна клітинна інфільтрація (рис. 1.3).
На 7 добу в зоні деструкції тканини мозку та її меж відзначалося скупчення зернистих куль. Нейрони у зоні деструкції не виявлялися. В області самого інфаркту мозку відзначалася виражена клітинна реакція та розрідженість нейропіля. Спостерігалася значна кількість запального клітинного інфільтрату. Добре виділявся незрілий гліомезодермальний рубець, що формується.
На 14 добу в осередку інфаркту та за його межами відзначалося значне скупчення клітин глії, що становлять основу глиомезодермального рубця. На той час ще відбувався процес організації зони деструкції.
У тварин 3 групи на тлі проведення сеансів ТЕС-терапії область інфаркту мозку, що формується, також починала виявлятися через 1 добу, як і в 2 групі. Однак клітинна відповідь та ознаки перицелюлярного набряку тканини мозку були менш виражені. У зоні інфаркту мозку спостерігалися поодинокі клітини-тіні.
Малюнок 3. Зріз тканини мозку щура групи 3. Ув. про. 40. Забарвлення за Нісслем.
Малюнок 4. Зріз тканини мозку щура групи 3. Ув. про. 40. Забарвлення гематоксилін-еозин
Капіляри у центрі області ішемії також запустювали (рис. 4.4). По периферії вогнища ішемії капіляри добре фарбувалися (рис. 4.5). Спостерігалося значно менше нейтрофілів (рис. 4.3), що пов'язано з меншим пошкодженням нейронів та меншою вираженістю запалення.
До 3 діб, після моделювання ІІ, область інфаркту мозку чітко виявлялася. Однак зона деструкції була вираженаменш значно. Кількість загиблих нейронів була значно меншою, ніж у щурів 2 групи. Нейронів з ознаками лише часткового тигролізу в деяких було більше. Гіперхромних дистрофічно змінених нейронів виявлялося мало. Запальна клітинна інфільтрація зони інфаркту тканини мозку була менш виражена, ніж у щурів 2 групи.
На 7 добу, після моделювання ІІ, нейронів у зоні деструкції тканини мозку не виявлено. Звертає увагу наявність на периферії області інфаркту мозку значної кількості новостворених капілярів, що проростають углиб зони деструкції, на відміну від тварин 2 групи.
Гліомезодермальний рубець виглядав більш сформованим у порівнянні з тваринами 2 групи, при цьому не блокував перебіг нервових волокон.
На 14 добу, після моделювання ІІ активно продовжувався процес організації зони деструкції. На її периферії формувався гліомезодермальний рубець. Він виглядав зрілішим і набагато менш щільним у порівнянні з тваринами 2 групи.
Згідно з даними літератури, завершення процесів формування вогнища інфаркту мозку відбувається до кінця 3 діб [9].
У 1 добу після моделювання ІІ у щурів 2 групи питомий об'єм вогнища інфаркту мозку був достовірно (р≤0,05) більшим на 4,2%, ніж у тварин 3 групи, яким проводили ТЕС-терапію після моделювання ІІ.
На 1 добу після моделювання ІІ у щурів 3 групи обсяг осередку інфаркту мозку достовірно (р≥0,05) не відрізнявся. Отже, проведення сеансів ТЕС-терапії після формування вогнища церебральної ішемії навіть у таких жорстких умовах як перманентне порушення мозкового кровотоку призводить до достовірного скорочення розмірів вогнища інфаркту мозку, порівняно з тваринами, яким ТЕС-терапія не проводилася. Питомий обсяг осередкуінфаркту мозку на 3 добу після моделювання ІІ у щурів 2 групи був достовірно (р≤0,05) більше на 21,6%, ніж питомий обсяг вогнища інфаркту мозку у щурів 3 групи.
Таким чином, ТЕС-терапія здатна позитивно впливати на клітинний склад і процеси організації вогнища інфаркту мозку, що здатне пояснити її нейропротективний ефект при експериментальному ішемічному інсульті.
Рецензенти:
Могильна Г.М., д.м.н., професор, завідувач кафедри гістології ДБОУ ВПО «Кубанський державний медичний університет МОЗ України», м. Краснодар;
Абушкевич В.Г., д.м.н., професор кафедри нормальної фізіології ДБОУ ВПО «Кубанський державний медичний університет МОЗ України», м. Краснодар.