Імунодіагностика.
Імунодіагностика – це використання реакцій імунітету для діагностики інфекційних та неінфекційних захворювань.
Реакції імунітету – це взаємодія антигену із продуктами імунної відповіді. У будь-якій реакції імунітету виділяють дві фази:
1) специфічну – обумовлена взаємодією антигену з антитілом та утворенням комплексу АГ – АТ;
Усі реакції імунітету поділяються на:
1) прості; беруть участь два компоненти (антиген та антитіло);
2) складні; беруть участь три компоненти і більше (антиген, антитіло, комплемент тощо).
У специфічну фазу відбувається швидке специфічне зв'язування активного центру антитіла з детермінантою артеріальної гіпертензії. Неспецифічна фаза проявляється видимими фізичними явищами (освіта пластівців, «парасолька», лінії преципітації як помутніння).
Імунні реакції використовують при діагностичних та імунологічних дослідженнях у хворих та здорових людей. Для цього він застосовують серологічні методи (від serum – сироватка).
У мікробіології та імунології широко застосовуються реакції аглютинації, преципітації, нейтралізації, реакції зв'язування комплементу, імуноферментний аналіз, імунофлюоресцентний метод, імуноблотинг.
Реакція аглютинації - РА,при якій відбувається зв'язування антитілами корпускулярних антигенів (бактерій, еритроцитів), вона протікає за наявності електролітів.
РА використовують для:
визначення антитіл у сироватці крові хворого, наприклад при бруцельозі (реакція Райта, Хеддельсона), черевному тифі та паратифах (р. Відаля), туляремії, кашлюку;
визначення збудника, виділеного від хворого;
визначення груп крові
Застосовуються різні варіанти реакції аглютинації: розгорнута, орієнтовна
Длявизначення у хворого антитіл ставлять у пробірках розгорнуту реакцію аглютинації: до розведень сироватки крові хворого додають діагностикум (суспензію вбитих мікробів) і через кілька годин інкубації при 37 0 С відзначають найбільше розведення сироватки (титр сироватки), при якому відбулася.
Якщо потрібно визначити збудник, виділений від хворого, ставлять орієнтовну реакцію аглютинації на предметному склі. До краплі діагностичної аглютинуючої сироватки у розведенні 1:10 або 1:20 додають чисту культуру збудника. Поруч ставлять контроль: замість сироватки наносять краплю фізіологічного розчину. При появі в краплі із сироваткою та мікробами пластівеподібного осаду ставлять розгорнуту реакцію аглютинації в пробірках. Одночасно враховуються контролі: сироватка, розведена ізотонічним розчином хлориду натрію повинна бути прозорою, завись мікробів в тому ж розчині рівномірно каламутної без осаду. В орієнтовній РА користуються адсорбованими аглютинуючими сироватками, з яких видалені перехресно реагують антитіла.
Реакція непрямої (пасивної) гемаглютинації (РНГА, РПГА)заснована на використанні еритроцитів з адсорбованими на їх поверхні АГ або АТ, взаємодія яких з відповідними АТ або АГ сироватки крові хворих викликає склеювання і при позитивних результатів відбувається випадання еритроцитів на дно полістиролової пластини як фестончатого осаду. При негативній реакції еритроцити осідають на дно пластини у вигляді «гудзика». РНГА застосовують для діагностики інфекційних хвороб (дифтерії, дизентерії, сальмонельозу, туляремії та ін.), Визначення гонадотропного гормону в сечі при встановленні вагітності, для виявлення підвищеної чутливості до лікарських препаратів,гормонів.
Реакція гальмування гемаглютинації (РТГА)заснована на блокаді, придушенні антигенів вірусів антитілами імунної сироватки, внаслідок чого віруси втрачають властивість аглютинувати еритроцити. РТГА застосовують для діагностики багатьох вірусних хвороб (грипу, кору, краснухи, кліщового енцефаліту).
Реакція преципітації- це формування та осадження комплексу розчинного молекулярного антигену з антитілами у вигляді помутніння, званого преципітатом. Розрізняють реакцію преципітації по Асколі визначення АГ збудника сибірки і реакцію преципітації в агарі визначення дифтерійного токсину.
Реакція зв'язування комплемена (РСК).Для постановки реакції зв'язування комплементу необхідні наступні інгрідеєдієнти:
1) випробувана сироватка (АТ);
2) антиген - вбита завись збудників того чи іншого захворювання;
РСК у тому, що з відповідності одне одному антигени і антитіла утворюють імунний комплекс, якого приєднується комплемент, тобто. відбувається зв'язування комплементу комплексом антиген-антитіло. Якщо ж комплекс антиген-антитіло не утворюється, то комплімент залишається вільним. РСК проводять у дві фази: 1-а фаза - інкубація суміші, що містить три компоненти антиген + антитіло + комплемент; 2-а фаза індикаторна - виявлення в суміші вільного комплементу шляхом додавання до неї гемолітичної системи, що складається з еритроцитів барана та гемолітичної сироватки, що містить антитіла. У позитивній реакції через зв'язування комплементу з комплексом антиген-антитіло гемолізу еритроцитів не відбудеться, і вони осядуть на дно пробірки у вигляді «парасольки». У негативних випадках зв'язування комплементу з комплексом антиген-антитіло не відбувається, він залишається вільним.приєднаються до комплексу еритроції – гемолітична сироватка, тим самим викликаючи гемоліз еритроцитів. РЗК застосовують для діагностики багатьох інфекційних захворювань, зокрема сифілісу (р.Вассермана), висипного тифу та ін.
Реакція нейтралізаціїпроводять шляхом введення суміші антиген-антитіло лабораторним тваринам. Наприклад, для виявлення ботулінічного токсину білим мишам підшкірно або внутрішньочеревно вводять витяжку з залишків їжі (гриби) з антитоксичними ботулінічними сироватками типів А, В, С, Е. Сироватки отримують з крові коней або великої рогатої худоби гіперімунізованих ботулінічними. За відсутності у тварин шкідливої дії мікроорганізмів, їх токсинів (миша залишилася жива) говорять про нейтралізуючу дію імунної сироватки і, отже, про специфічність взаємодії комплексу АГ-АТ.
Реакція імунофлюоресценції РІФ (метод Кунса).
Прямий метод РІФ заснований на тому, що антигени тканин або мікроби, оброблені імунними сироватками з антитілами, міченими флюорохромами, здатні світитися в УФ-променях люмінісцентного мікроскопа. Бактерії в мазку, оброблені такою люмінісцентною сироваткою, світяться у вигляді облямівки зеленого кольору. Даний метод є методом експрес-діагностики виявлення антигенів мікробів або антитіл.
Імуноферментний метод (ІФА).Принцип методу наступний: на твердофазному носії (поверхня лунок полістиролового планшета) фіксується АГ збудника інфекції, антитіла до якого необхідно виявити. Антиген, іммобілізований на поверхні твердого носія, називають иммуносорбентом. В ході інкубації імуносорбенту з випробуваною сироваткою при наявності в ній АТ до цього АГ відбувається їх зв'язування в комплекс антиген-антитіло. Потім слідуєінкубація з міченими ферментом антитілами до імуноглобулінів людини (кон'югатом), в ході якої на поверхні носія відбувається приєднання до комплексу антитіл, мічених ферментом (як фермент найчастіше використовується пероксидаза хрону). Кон'югат отримують на основі поліклональних антивидових АТ, наприклад кролячі АТ або моноклональних АТ, спрямованих проти людських імуноглобулінів певного класу M, G, A. Надалі при додаванні субстрату відбувається його взаємодія з ферментом, в результаті чого розвивається кольорова реакція, інтенсивність якої залежить від кількості пов'язаних сироваткових АТ. При використанні пероксидазного кон'югату як субстрат застосовують перекис водню у поєднанні з ортофенілдіаміном. Результати реакції оцінюються спектрофотометрично з виведенням цифрових даних, що виключає суб'єктивність оцінки антитіл. ІФА застосовують для діагностики вірусних, бактеріальних та паразитарних хвороб, зокрема для діагностики ВІЛ-інфекцій, гепатиту В, цитомегаловірусної інфекції, герпесної, токсоплазмової, а також визначення гормонів, ферментів, лікарських препаратів та інших біологічно активних речовин.
Імунний блот.В Україні в даний час стандартною процедурою лабораторної діагностики ВІЛ-інфекції є виявлення антитіл до ВІЛ з подальшим підтвердженням їх специфічності в реакції імунного блот. Виявлення антитіл до ВІЛ включає два етапи. На першому етапі проводиться виявлення сумарного спектру антитіл (ІФА), на другому етапі методом імунного блотингу проводиться визначення антитіл до окремих білків вірусу, іммобілізованих на нітроцелюлозну мембрану. Білки оболонки вірусу ВІЛ1, що позначаються як глікопротеїни («gp» джипі) з молекулярною вагою, вираженою вкілодальтонах: 160кд, 120кд, 41кд. У ВІЛ2 глікопротеїни мають вагу 140 кд, 105кд, 36кд. Білки серцевини (gag), що позначаються як протеїни («p» пі) у ВІЛ1 мають молекулярну вагу відповідно 55кд, 24кд, 17кд, а ВІЛ2 – 56кд, 26кд, 18кд. Результати інтерпретуються як позитивні, в яких виявляються антитіла до 2 або 3 глікопротеїнів ВІЛ. Негативними вважаються сироватки, у яких немає антитіл до жодного з білків.