Колориметричні методи
Колориметричні методи, засновані на визначенні ступеня забарвлення сполук, що утворюються в результаті різних "кольорових реакцій": а) метод Сомоджі (1933), в якому використовується здатність глюкози відновлювати гідрат окису міді в закис міді, що у свою чергу перетворює арсено-молібденову кислоту в молібденову блакить. Цей метод неспецифічний, трудомісткий і нині рідко застосовується у клініко-діагностичних лабораторіях; б) метод Фоліна-Ву (1919), що полягає у визначенні забарвлення молібдену синього, який утворюється внаслідок відновлення тартрату міді у окис міді. Остання, взаємодіючи з молібдотустенгоновою кислотою, дає кольорову реакцію. Метод відносно простий: негативною стороною його є те, що між глюкозою, що є в крові, і одержуваним забарвленням не існує суворої пропорційності; в) метод Крезеліус - Зейферт (1928, 1942) заснований на відновленні пікринової кислоти в пікрамінову з подальшим колориметруванням. Метод швидкий, але дуже точний. Помилка може перевищувати 10-20%. У зв'язку з цим зазначений метод має орієнтовне значення; г) метод з антроновим реактивом Моррісом (1948) і Рое (1955). Антроновий метод полягає у колориметруванні кольорового комплексу, що утворюється в результаті з'єднання антрону з вуглеводами. Точні результати можуть бути отримані за наявності високоочищених хімічних реактивів та дотримання постійної температури; д) орто-толуїдиновий метод Гультмана в модифікації Хіваринена - Нікілла (1962), що полягає у визначенні інтенсивності фарбування розчину, що виникає при взаємодії орто-толуїдину з глюкозою. Цей метод специфічний і точний, дає можливість визначати "справжню" глюкозу і тому пропонується як уніфікований. Недоліки полягають узастосування неорганічних (оцтова кислота) та органічних (ТХУ) кислот та етапу кип'ятіння. Схема реакцій орто-толуїдинового методу: Білки крові + ТХУ ---> денатурація та осадження глюкоза (Н+, нагрівання) -----> оксиметилфурфурол оксиметилфурфурол + о-толуїдин ------> синьо-зелене забарвлення
Глюкозооксидазні методи
Сьогодні найбільшого поширення набули методи, засновані на використанні ферменту – глюкозооксидази. Глюкозооксидаза каталізує перенесення двох водневих атомів з першого вуглецевого атома глюкози на кисень, розчинений у рідкому реагенті. При цьому в ході реакції утворюється в еквімолярних кількостях перекис водню. Тобто. концентрація перекису водню, що утворилася, точно дорівнює визначеній концентрації глюкози. Отже, використання глюкозооксидазної реакції трансформувало завдання визначення концентрації глюкози в завдання визначення концентрації перекису водню, яка, як буде показано нижче, значно простіше першої. І тут є кілька способів, які широко використовуються сьогодні в лабораторній практиці. Серед вищеперелічених способів реєстрації найбільшого поширення набув фотометричний біохімічний метод, в якому молекули перекису водню під дією ферменту пероксидази розщеплюються з утворенням активної форми кисню - супероксид аніон-радикала - О2-, який у свою чергу окислює хромоген, що призводить до значної зміни спектру поглинання хромогену . Максимум поглинання реакційної суміші (реактив + глюкоза) знаходиться в області 500 нм. Відповідно зміна оптичної щільності кінцевої реакції на довжині хвилі 480-520 нм пропорційно концентрації глюкози, що міститься в пробі. Велика популярність даного методу визначення глюкози пояснюється його високою специфічністюпростотою виконання. Метод можна реалізувати як із застосуванням звичайного фотометра КФК-2, КФК-3 або мініфотометрів МКМФ-02, МІНІЛАБ 501, так і за допомогою автоматичних біохімічних автоаналізаторів.
Глюкозооксидазний метод визнаний сьогодні одним із найточніших кількісних методів визначення глюкози. Як біологічний матеріал використовується як сироватка крові, так і цільна кров. Працюючи з останньою слід враховувати те що, що з взяття капілярної крові частка сироватки (плазми) залежить від величини гематокриту, що може негативно позначитися на точності результату. Тому для визначення глюкози вищеописаним методом переважно використовувати сироватку крові пацієнта. Поряд з методом фотометрування по кінцевій точці кілька років тому з'явилися набори, в яких реалізований кінетичний метод фотометрування. Суть методу полягає в тому, що при певному співвідношенні активностей глюкозооксидази та пероксидази швидкість утворення забарвленої сполуки деякий час після внесення проби в робочий розчин буде пропорційна концентрації глюкози в пробі. Перевага такого методу полягає в тому, що результат не залежить від наявності в пробі інших сполук, оскільки поглинання останніх є стабільним у часі. Звичайно, цей метод вимагає застосування кінетичного фотометра, проте сьогодні це вже не проблема, оскільки у багатьох лабораторіях є як імпортні фотометри типу HUMALAISER (Німеччина), HOSPITEX (Швеція), Стат Факс та ін., так і вітчизняні серії МІНІЛАБ. Вимір концентрації глюкози з цільної крові зручно виконувати за допомогою приладів, робота яких заснована на амперометрическом принципі вимірювання, за допомогою спеціальних ферментних датчиків. Перекис водню є вкрай нестабільною хімічною сполукою, івона може бути джерелом заряджених частинок. Саме це використовується в ферментних датчиках мембранного типу або електрохімічних елементах портативних глюкометрів.
У вимірювальній комірці, сконструйованій як проточна, знаходиться вимірювальна камера, з одного боку обмежена ферментною мембраною. На мембрану товщиною близько 60 мікрон спеціальним чином сорбована глюкозооксидаза. З іншого боку мембрани до неї притискається платиновий електрод. Проба цільної крові (зазвичай 20 мкл) розлучається в системному буферному розчині (еритроцити руйнуються), після чого подається по магістралі в проточний осередок. Глюкоза піддається окисленню під впливом ферменту глюкозооксидази, що знаходиться на мембрані. Перекис водню, що утворився, дифундує через мембрану і окислюється далі в каталітичній реакції під дією платини. Дифузія перекису водню поверхню платини формує струм, пропорційний числу молекул Н2О2. Отриманий таким чином сигнал обробляється приладом відповідне значення напруги. Це виміряне значення пропорційно до концентрації глюкози в проби. Як приклад приладів, що використовують вищеописаний метод, назвемо автоматичні аналізатори глюкози ЕКСАН (Латвія), БІОСЕН 5030/5040 (Німеччина) та вітчизняний напівавтоматичний аналізатор глюкози АГКМ-01. Ці прилади особливо привабливі для поліклінік, де аналіз глюкози роблять переважно з капілярної крові. Важливим етапом у розвитку методів клінічної лабораторної діагностики стала поява "сухої хімії". Звичайно, одним з перших додатків цієї технології стало завдання визначення глюкози в крові пацієнта. Перші прилади значно поступалися за точністю традиційним лабораторним методам досліджень. Однак, згодом, низці фірм вдалосярозробити такі діагностичні смужки та відбивні фотометри, які забезпечили дуже високу точність аналізу. Компанією "Lifescan" були створені унікальні тест-смужки та прилад до них, які вдало поєднують у собі аналітичну точність кількісного ферментативного методу зі швидкістю та простотою "сухої хімії".
На закінчення слід згадати і про недоліки глюкозооксидазного методу. Перекис водню, що утворюється, і супероксид аніон-радикал можуть окислювати не тільки хромоген, але й інші речовини, присутні в біологічній рідині: аскорбінову кислоту, сечову кислоту, білірубін. При цьому відповідно частка перекису, що бере участь в окисленні хромогену, знижується, що призводить до заниження результату по глюкозі. Цей метод линеен, як правило, до 20-30 ммоль/л глюкози.
Гексокіназний метод складається з двох послідовних реакцій, але зовсім інших: Реакція реєструється при 340 нм. за освітою НАДН. Цей метод є високоспецифічним та не дає реакції з іншими компонентами сироватки крові. Гексокіназний метод вважається референтним визначення глюкози. Як правило, він лінійний до 50 ммоль/л, що дозволило його широко рекомендувати для клінік з ендокринологічними відділеннями. З описаного розмаїття методів визначення глюкози співробітники КДЛ можуть вирішити собі, який спосіб визначення і який вибрати. Методи "мокрої" біохімії забезпечать потреби лабораторій із великим потоком аналізів. Зупиняючись на діагностичних наборах рідкої біохімії для визначення глюкози в клінічній практиці широко використовуються як глюкозооксидазний, так і гексокіназний метод. З вітчизняних виробників наборів на глюкозу, що відрізняються якісними характеристиками, можна виділити такі фірми як VitalDiagnostics (C-Петербург), Вектор-Бест (Новосибірськ); із зарубіжних фірм - НUMAN (Німеччина), Лахема (Чехія). Прилади типу BIOSEN, ESAT, АГКМ-01 вимагають від оператора мінімальних витрат, оскільки вони повністю автоматизовані. Вони досить продуктивні (швидкість від 50 до 90 проб на годину). Для лабораторій з невеликою кількістю досліджень, а також експрес-лабораторій глюкометри типу "ONE TOUCH" дуже корисні. Т.ч., завдання КДЛ - виходячи зі своїх реальних можливостей, забезпечити не тільки швидке, а й високоточне визначення глюкози, на сьогоднішній день цілком вирішуване.
Варто розглянути вимірювальний міст як основний елемент РЕА призначених для вимірювання опору шляхом порівняння з еталоном зразків. Розглянемо докладно принцип впливу елемента.
Вимірювальний міст (міст Уітстона, місток Вітстона)— пристрій для вимірювання електричного опору, запропонований в 1833 Самуелем Хантером Крісті, і в 1843 удосконалений Чарльзом Уітстоном. Міст Вітстон відноситься до одинарних мостів на відміну від подвійних мостів Томсона. Електричний аналог важільних аптекарських терезів. Принцип вимірювання заснований на взаємній компенсації опорів двох ланок, одна з яких включає вимірюваний опір. Як індикатор зазвичай використовується чутливий гальванометр, показання якого повинні дорівнювати нулю в момент рівноваги моста.
Неврівноважений вимірювальний міст із вольтметром
На схемі , , , - плечі моста, AD - діагональ живлення, CB - вимірювальна діагональ. є невідомим опір; і відомі опори, причому значення може регулюватися. Якщо відношення опорів дорівнює відношенню опорів, то різниця потенціалів між двома середніми точками будедорівнює нулю, і струм між ними не протікатиме. Опір регулюється до отримання рівноваги, а напрямок перебігу струму показує, в який бік потрібно регулювати.
За допомогою гальванометра момент рівноваги можна встановити з великою точністю, і якщо опори і мають малу похибку, то може бути виміряно дуже точно, адже навіть невеликі зміни викликають помітне порушення балансу всього мосту.
Таким чином, якщо міст збалансований (струм через гальванометр, опір якого можна позначити як дорівнює нулю), еквівалентний опір ланцюга буде:
у паралелі з , тобто