Лабораторна діагностика класичної чуми свиней
Е-1. Чутливість методу становить 10 ТЦД50.
Виділення вірусу.Для виділення вірусу беруть проби крові, шматочки селезінки, мигдалин, лімфовузлів, грудної кістки, нирок та легень від 2-3 тварин у перші 2год після загибелі або забою хворих в атональному стані. Матеріал відбирають у стерильні флакони, закривають гумовими пробками, флакони обробляють зовні 5%-ним розчином хлораміну або освітленим 20%-ним розчином хлорного вапна, обгортають марлею, змоченою дезінфікуючим розчином, і поміщають у поліетиленовий пакет. Взятий патматеріал поміщають у термос з льодом, опечатують і відправляють із нарочним у лабораторію із супровідним документом. У лабораторії з кожної проби готують 20% суспензію на 0,85% розчині NaCl, яку тричі заморожують і відтають, центрифугують при 3-4 тис. хв- 1 20-30 хв. Надосадову рідину обробляють антибіотиками 1год при 37°З використовують для виділення вірусу.
Виділення вірусу в культурі клітин. Використовують культуру клітин РК-15, що перевивається, вирощену на скляних пластинках. На кожну пробу матеріалу беруть не менше 8 пробірок, які вносять по 0,4 мл досліджуваного матеріалу. Адсорбують вірус 2 год 137°С, потім його видаляють, клітини відмивають середовищем і заливають 2 мл підтримуючого середовища з 2% сироватки теляти. Для контролю за якістю культури клітин залишають 10 пробірок незарядженими. Інкубують 24-96 год. ВКНС у культурі клітин РК-15 не викликає, тому індикацію його проводять методом прямої ІФ. Через 24-96 год після інокуляції пластинки з моношаром клітин вилучають з пробірок, підсушують на повітрі і 10 хв фіксують у холодному (4°С) ацетоні, підсушують на повітрі і поміщають їх клітинами вниз на краплі ФІТЦ-Ig ВКЧС, нанесеного в робочому розведенні на предметне скло. Препарати витримують у вологійкамері 30 хв при 37°С, потім промивають у посудині з 0,01 M ФСБ з рН 7,2-7,5 30-40 хв у темному місці, обполіскують у дистильованій воді, підсушують на повітрі і укладають у забуферений гліцерин (9 частин гліцерину та 1 частина 0,01 М ФСБ з рН 7,5). Для цього на знежирене предметне скло наносять краплю забуференого гліцерину, поміщають препарат клітинами вниз і заливають краї розплавленим парафіном. Переглядають під люмінесцентним мікроскопом.
В інфікованих препаратах, оброблених ФІТЦ-Ig, АГ вірусу виявляють по яскраво-зеленому дифузному світінню цитоплазми уражених клітин, що розташовуються групами, які називають флюоресцентними мікробляшками. Через 24-48 год у культурі клітин РК-15 спостерігають появу мікробляшок. За їх відсутності у першому пасажі проводять 2-й та 3-й пасажі випробуваного матеріалу з наступним ІФ через 24-96 год.
Індикація та ідентифікація вірусу.Гістологічні дослідження.Проводять з метою виявлення специфічних змін нервових тканин. Від полеглих або вбитих свиней беруть шматочки півкулі головного мозку, мозочка, амонових рогів, спинного мозку у різних ділянках. Гістологічні препарати забарвлюють гематоксилін-еозином. У більшості випадків (70-93%) у ЦНС виявляють негнійний лімфоцитарний енцефаломієліт, що характеризується периваскулярними лімфоцитарними інфільтратами, осередковою проліферацією клітин мікроглії (гліальних вузликів) та дистрофією гангліозних клітин. В зрізах, приготованих з лімфовузлів, серцевого м'яза та печінки, можна виявити присутність ацидофільних внутрішньоядерних тілець-включень, дещо менших, ніж ядерця. У лімфовузлах їх знаходять на 6-12-й день після зараження.
ВКНС має виражений гематотропізм щодо кісткового мозку, що містить більшу кількістьбластних клітин, ніж лімфовузли та селезінка. Тому кістковий мозок уражається першим; інгібуються мієлопоетичні та еритропоетичні клітини та проліферують великі клітини з базофільною цитоплазмою. Поряд із цим виявляють картину глибокого цитолізу та дистрофію лімфопоетичних органів.
При підозрі на чуму для уточнення діагнозу кілька тяжкохворих тварин вбивають і досліджують мазки з кісткового мозку грудної клітки.
Біопроба. З благополучного з інфекційних хвороб господарства беруть поросят віком 2-3 міс масою 20-30 кг. Як матеріал використовують 10%-ну суспензію, приготовлену з органів (селезінки, лімфовузлів, кісткового мозку) або крові від загиблих тварин. Суспензію обробляють антибіотиками, витримують не менше 4 годин при 4°С, центрифугують і надосадову рідину використовують для зараження тварин. Трьом поросятам вводять підшкірно по 1 мл крові або 2 мл суспензії органів. Двом тваринам матеріал, що досліджується, не інокулюють, містять їх окремо для контролю. Двом поросятам, імунним до ВКНС, вводять досліджуваний матеріал у тих же дозах з метою диференціальної діагностики щодо АЧС. За всіма тваринами спостерігають 21 день та щодня вимірюють температуру тіла.
Діагноз вважають позитивним, якщо 2 з 3-х неімунних поросят хворіють, виявляючи симптоми хвороби, і гинуть, а 2 імунних залишаються здоровими або виявляють незначні та короткочасні (1-4 дн) ознаки хвороби слабкої інтенсивності (підвищення температури тіла не вище 41°С) ). Однак слід мати на увазі, що за відсутності реакції у сприйнятливих тварин або у разі її недостатньої виразності, не можна з упевненістю виключити присутність вірусу у досліджуваному матеріалі. Негативний результат зараження може бути наслідком або дуже малогокількості в ньому вірусу або слабкої вірулентності останнього. Тому наступним кроком є повторне, через 3-6 тижнів після інокуляції досліджуваного матеріалу, зараження (реінфекція) піддослідних свиней цього разу вірусом із відомою вірулентністю. Відсутність у тварин реакцію це зараження свідчить про придбання ними імунітету внаслідок першої інокуляції (безсимптомного перехворювання) і опосередковано свідчить про наявність вірусу в досліджуваному матеріалі. Одночасно з проведенням другої проби додатково заражають двох сприйнятливих поросят (контроль) вірусом, використаним для реінфекції.
Іноді біологічна проба себе не виправдовує чи дає неясні результати виділення штамів вірусу, викликають легке захворювання. Такі штами у інокульованих поросят викликають хронічну хворобу. Справа ускладнюється тим, що штами зі слабкою вірулентністю можуть не мати імунізуючі властивості, а це не дозволяє уточнити діагноз при використанні додаткового контрольного зараження вірулентним штамом (реінфекції). При діагностиці захворювання, обумовленого такими штамами, можуть знадобитися молоді тварини та додаткові пасажі для підвищення вірулентності.
Запропоновано шкалу оцінки вірулентності польових штамів ВКНС:
- Слабовірулентні (патогенні лише для поросят-сосунів) не імунізують штами. Поросята-сосуни хворіють у перші дні життя і смертність їх велика, поросята-відйоми (12-15 кг) реагують тільки в певні дні підйомом температури тіла, не набуваючи імунітету;
- Слабовірулентні (патогенні для молодих тварин) імунізуючі штами. У тварин масою 15-20 кг розвивається хронічна хвороба, підсвинки масою 35 кг реагують підйомом температури тіла, що триваєдекілька днів. На розтині виявляються незначні точкові крововиливи. Тварини набувають імунітету;
- Сильно вірулентні штами викликають у тварин масою 30 кг гостре захворювання, смертність 40% і більше. На розтині характерні геморагічні зміни.
Тест модуляції фагоцитарної активності макрофагів. Дефіцит фагоцитарної функції призводить до порушення локальних імунних реакцій із розвитком запальних процесів на слизових оболонках. При КЧС відбувається локалізація фагоцитарної функції лейкоцитів при репродукції вакцинного шт. ЛК-ВНИВВиМ знижується відсоток та індекс фагоцитозу нейтрофілів та макрофагів, а при репродукції вірулентного вірусу шт. Ши-Минь підвищується відсоток та індекс фагоцитозу нейтрофілів і знижується такий у макрофагів. При КЧС in vivo та in vitro фагоцитарна активність лейкоцитів крові короткочасно (до 4 діб) знижується при інфікуванні вакцинним штамом та підвищується у макрофагів при інфікуванні вірулентним штамом ВКНС. Встановлений в інфікованих клітинах-мішенях цитопатичний ефект, що виявляється у модуляції фагоцитарної активності свинячих макрофагів, використовують у діагностиці КНС.