Механізм та етапи фарбування за Грамом
Практикум: Мікроскопічне вивчення живих (нативних) та пофарбованих мікробів.
Мікроскопічний метод у мікробіології. Методичні основи.
Мікроскопія у світловому оптичному мікроскопі.
Світловий мікроскоп складається з механічної та оптичної частини. Механічна частина мікроскопа - це штатив, що складається з основи та колонки, до якої прикріплені тубус та предметний столик. У колонці є дві гвинтові системи установки тубуса. Оптична частина мікроскопа складається з освітлювального апарату, об'єктивів та окулярів. Освітлювальний апарат розташований під предметним столиком. У більшості мікроскопів світло відбивається від дзеркала і, пройшовши через лінзи конденсора, фокусується у площині препарату. У сучасних мікроскопах освітлення досягається за допомогою вмонтованого в мікроскоп джерела світла. Об'єктиви є системою лінз в металевій оправі. Передня (фронтальна) лінза – найменша. Від неї переважно залежить збільшення мікроскопа. Розташовані за нею лінзи називаються корекційними, оскільки призначені для усунення недоліків оптичного зображення. При мікроскопії об'єктив занурюють у краплю олії, тому об'єктив називають імерсійним об'єктивом (лат. immercio – занурення), а олія – імерсійною олією. Іммерсійний об'єктив вимагає особливо обережного поводження. Фронтальна лінза має настільки коротку фокусну відстань до об'єкта, що досліджується, що опускати об'єктив потрібно повільно, дивлячись збоку, щоб не роздавити препарат, що пов'язано з псуванням лінзи. Окуляри мають дві лінзи: верхня називається очною, а нижня – збірною. Окуляри позначають за тим збільшенням, що вони дають, наприклад: х7, х10, х15 тощо. Межа роздільної здатності оптичного мікроскопа дорівнює 0,2 мкм.
Забарвлення мікроорганізмів - комплекс методів вивчення структури та морфології мікроорганізмів при мікроскопії препаратів, приготованих із чистих культур або досліджуваного матеріалу.
Фіксовані бактерії забарвлюються краще за живі, оскільки клітинна стінка і цитоплазматична мембрана живої клітини обмежують проникнення в неї барвника.
Приготування забарвленого препарату включає низку етапів:
1) приготування мазка;
2) висушування мазка;
3) фіксацію мазка;
Мазок готують на чистих предметних шибках, на середину яких наносять невелику краплю води і в неї за допомогою бактеріологічної петлі поміщають досліджуваний матеріал. Матеріал розподіляють на склі рівномірним тонким шаром, розмір мазка -1-2 см2.
Препарат зазвичай висушують за кімнатної температури на повітрі. Для прискорення висушування допускається підігрів мазка в струмені теплого повітря високо над полум'ям пальника.
Висушений мазок піддається фіксації, при якій мазок прикріплюється до скла (фіксується), а мікроби стають сприйнятливішими до фарбування. Способів фіксації багато. Найпростіший і найпоширеніший - фіксація жаром - нагрівання на полум'ї пальника (препарат проводять кілька разів через найбільш гарячу частину полум'я пальника). У ряді випадків вдаються до фіксації рідинами (етиловий або метиловий спирт, ацетон, суміш рівних обсягів спирту та ефіру - за Нікіфоровим).
Після фіксації мазок фарбують. Кількість фарби, що наноситься на препарат, повинна бути такою, щоб покрити всю поверхню мазка. Після закінчення терміну фарбування (2-5 хв) фарбу зливають і препарат промивають водою.
Існують прості, складні та диференціальні способи фарбування мікробів. При простому забарвленні зазвичай вживають однуфарбу, найчастіше червону – фуксин, або синю – метиленовий синій. Фуксин фарбує швидше (1-2 хв.), Метиленовий синій - повільніше (3-5 хв.). Фуксин готують у вигляді концентрованого карболового розчину (фуксин Ціля), дуже стійкого та придатного для фарбування протягом багатьох місяців. Метиленовий синій готується заздалегідь у насиченому спиртовому розчині, який стійкий і може довго зберігатися.
Основні види барвників, що застосовуються у мікробіологічній практиці: