МЕТОД ФЛУОРЕСЦІЙНИХ АНТИТЕЛ (МФА)

Мета заняття. Ознайомити студентів з принципом методу флуоресціюючих антитіл та технікою постановки реакції імунофлуоресценції, з принципом та технікою проведення ім-муноферментного аналізу.

Обладнання та матеріали. Інактивовані культури бруцел і сальмонел, 96%-й етанол, ФСБР (рН 7,2. 7,4), «волога камера» (чашки Петрі, ексікатор), люмінесцентні сироватки проти бруцел, сальмонел, імуноглобулінів кролика, позитивна бруцельозна сироватка, готовий препарат для демонстрації результатів ІФА, люмінесцентний мікроскоп.

У названих серологічних реакціях використовують антитіла (імунні сироватки), мічені флуорохромом або ферментами, і надалі, застосовуючи спеціальні методи, реєструють утворення комплексу антиген - антитіло. У деяких варіантах ІФА вводять ферментну мітку в антиген.

Метод флуоресціюючих антитіл (МФА). Цей комплексний метод поєднує серологічну реакцію, при якій відбувається специфічна взаємодія антигену і антитіла з утворенням імунного комплексу, і мікроскопічне дослідження, за допомогою якого цей комплекс виявляють.

У реакції імунофлуоресценції використовують антитіла, до яких приєднано флуорохром (частіше флуоресцеїн - ізотіоцинат). Такі антитіла зберігають здатність специфічно реагувати з антигеном та завдяки флуорохрому світитися під впливом ультрафіолетових променів. При постановці МФА мікробний антиген фіксують на предметному склі та обробляють люмінесцентними антитілами. Потім препарат відмивають водою від антитіл, що не зв'язалися, і переглядають у люмінесцентному мікроскопі. Якщо антитіла специфічно відповідають даному антигену, вони утворюють з антигеномміцний комплекс і при люмінесцентній мікроскопії в препараті виявляють мікробні клітини, що світяться (рис. 70).

Перевага МФА як діагностичного методу полягає в тому, що за його допомогою можна за дві-три години серологічно ідентифікувати мікроорганізм безпосередньо в патологічному матеріалі, без виділення чистої культури (експрес-метод). Як і інші серологічні реакції, МФА застосовують і виявлення антитіл у крові тварин.

Приготування препарату для МФА. При виявленні збудника інфекції (антигену) на предметному склі готують мазки-відбитки з органів чи іншого матеріалу. Щоб виявити антитіла в досліджуваній сироватці крові, на предметному склі готують мазки з відомого антигену, наприклад, збудника сальмонельозу, сибірки та ін. етанолом (10. 15 хв), або метанолом (5. 10 хв). Препарат можна фіксувати і нагріванням, як за звичайної світлової мікроскопії. Мазки-відбитки з органів та тканин краще обробляти охолодженим до -20 ° С ацетоном 2. 4 хв. Залежно від конкретних завдань фарбування готових препаратів люмінесцентними сироватками проводять у різний спосіб.

Прямий МФА. Розробив Coons з співавт. (1950). На предметне скло з фіксованим антигеном наносять краплю люмінесцентної імунної сироватки в робочому розведенні, що містить антитіла проти антигену, що шукається. Щоб уникнути висихання, препарат поміщають у вологу камеру (чашку Петрі) з фільтрувальним папером, змоченою водою, і витримують у термостаті при 37…38 °С 15…30 хв. Потім препарат 5. 10 хв промивають від нез'єднаних імуноглобулінів проточною (водопровідною) водою з рНне нижче 7,0. Промитий препарат висушують фільтрувальним папером та мікроскопують.

Прямий МФА використовують лише для ідентифікації невідомого антигену; до його недоліку відносять необхідність приготування люмінесцентної сироватки для кожного виду мікроорганізму, що ідентифікується.

Непрямий МФА. Застосовують у двох варіантах.

Двоступінчастий МФАзапропонували Weller та Coons (1954). Цей варіант вважають більш універсальним, тому що за допомогою однієї люмінесцентної антивидової сироватки можна виявляти різні види мікроорганізмів.

На антиген наносять краплю неміченої імунної сироватки (сироватка першого ступеня). Препарат витримують у термостаті 15. 30 хв, потім його промивають, щоб видалити антитіла імунної сироватки, що не зв'язалися, і просушують (див. прямий варіант). Якщо антитіла сироватки першого ступеня відповідають антигену, то вода не вимиває АГ-АТ-комплекс, що утворився (антитіла зафіксовані на антигені).

На підсушений препарат наносять краплю люмінесцентної антивидової сироватки (сироватка другого ступеня) у робочому титрі. Препарат повторно поміщають термостат у вологій камері на 15. 30 хв, потім промивають водою і підсушують. Антивидова сироватка є мічені флуорохромом антитіла проти імуноглобулінів крові тваринного того виду, від якого отримана імунна сироватка першого ступеня. Таким чином, антитіла першої сироватки є антигеном для мічених антитіл антивидової сироватки. В результаті до АГ-АТ-комплексу, що утворився на першому етапі, приєднуються антитіла другого ступеня, утворюється подвійний комплекс, який можна виявити в люмінесцентному мікроскопі.

Універсальність непрямого варіанта обумовлена тим, що, використовуючи на першому етапі отримані від тваринодного виду (наприклад, від коней) імунні сироватки проти різних мікроорганізмів, на другому етапі за допомогою однієї антивидової сироватки можна ідентифікувати необмежену кількість збудників інфекційних хвороб.

Триступеневий МФА є варіант РСК на склі. В даному випадку в імунному комплексі на склі за допомогою люмінесцентної сироватки виявляють пов'язаний комплемент (рис. 71).

Двоступінчастим або триступеневим МФА при використанні відомого антигену можна виявляти антитіла у крові тварин.

Для підтвердження специфічності результатів МФА потрібні контролі. Для прямого варіанту достатньо одного контролю: гомологічні та гетерологічні в антигенному відношенні мікроорганізми обробляють люмінесцентною сироваткою. У першому випадку спостерігають свічення бактерій, у другому свічення відсутнє.

Для непрямого варіанта ставлять два контролю: 1) мазки, що містять гомологічні та гетерологічні в антигенному відношенні мікроорганізми, обробляють антивидовою люмінесцентною сироваткою. За відсутності антитіл першого ступеня клітини не повинні люмінесцувати; 2) мазки з гомологічними і ге-терологічними в антигенному відношенні бактеріями обробляють імунною (антимикробною) сироваткою (перший етап) з подальшим нанесенням флуоресцентної антиглобулінової (антивидової) сироватки (другий етап). Специфічне світіння бактерій спостерігають у першому випадку, у другому воно відсутнє.

Оцінка результатів МФА. Враховують яскравість свічення, колір, локалізацію та структуру свічення. У бактерій, пофарбованих (оброблених) люмінесцентною сироваткою, міченою ізоціанатом флуоресцеїну, зазвичай спостерігають яскраве зелене свічення по периферії клітини у вигляді обідка або ореолу, центральна частинабактерій світиться слабо. Такий характер світіння пояснюють тим, що з одиниці площі периферії мікробної клітини на сітківку ока спостерігача проектується в кілька разів більше антитіл, ніж з центральної її частини. Слід враховувати, що у пластичних бактерій (лептоспіри, вібріони) світиться вся клітина. У клітин, занурених у тканинну рідину, і у молодих бацил сибірки контур зазвичай виражений нерізко.

Інтенсивність світіння оцінюють за чотирихрестовою системою: 1) (++++) - дуже яскрава флуоресценція по периферії мікробної клітини, що чітко контрастує з темною центральною частиною клітини; 2) (+++) – яскрава флуоресценція периферії клітини; 3) (++) - слабке світіння периферії клітини; 4) (+) - немає контрастного світіння периферії та центральної частини мікробної клітини. Відсутність специфічного світіння позначають знаком «мінус» (видні тіні мікроорганізмів). При діагностиці різних збудників хвороб позитивним результатом частіше вважають специфічне світіння бактеріальних клітин не нижче, ніж чотири чи три хреста.

Імуноферментний аналіз (ІФА). Цей метод набув поширення після того, як було вирішено завдання введення ферментної мітки в молекули антитіл або антигенів. Антитіла, пов'язані з ферментом, зберігають здатність специфічно реагувати з гомологічним антигеном, а фермент взаємодіяти з відповідним субстратом.

ІФА зазвичай використовують у гістохімічному (імунопероксидазна реакція) та твердофазному варіантах.

Гістохімічний ІФА. За допомогою цього методу зазвичай виявляють мікробні антигени в мазках-відбитках, мазках крові, гістозрізах. Як і у випадку МФА, пероксидазну реакцію використовують у прямому та непрямому варіантах.

Пряма імунопероксидазна реакція.Яквідомого компонента використовують, мічені пероксидазою антитіла проти будь-якого патогенного мікроорганізму. Препарат, наприклад мазки-відбитки, фіксують охолодженим ацетоном (-15. -20 °С), підсушують, наносять чотири-п'ять крапель кон'югату в робочому титрі (мічені антитіла), інкубують у вологій камері при 37 °С 1. 2 год, промивають розчином 15 хв, обполіскують дистильованою водою, підсушують, наносять на препарат кілька крапель розчину субстрату (25 мг 3,3-ДАБ • 4НС1 розчиняють у 100 мл 0,05 М трис-буфера з рН 7,5 та 25 мл цього розчину об'єднують з 3 мл 0,5%-го розчину перекису водню). Препарат із субстратом витримують 5. 10 хв, промивають у фізіологічному розчині 10 хв, обполіскують дистильованою водою та мікроскопують.

Якщо в досліджуваному матеріалі присутній мікробний антиген, то мічені пероксидазою антитіла з ним специфічно зв'язуються. Внесення субстрату до пероксидази призводить до утворення кольорового продукту, видимого при мікроскопії спочатку як гранули блакитного, пізніше жовто-коричневого кольору.

Непряма імунопероксидазна реакція.Як і в МФА, використовують мічені пероксидазою антитіла імуноглобудинам певного виду тварин. На першому етапі фіксований охолодженим ацетоном препарат з досліджуваним матеріалом обробляють у вологій камері при 37. 38 ºС 1. 2 ч імунною сироваткою (0,2. 0,3 мл), що містить немічені антитіла до шуканого антигену. Потім препарат промивають фізіологічним розчином 5 хв, підсушують і обробляють при 37…38 °С 1…6 год у вологій камері антитілами, міченими пероксидазою (кон'югат у робочому розведенні). Наступні операції та облік результатів аналогічні прямому варіанту пероксидазної реакції.

Твердофазний ІФА. Застосовують найбільшшироко. У цьому випадку антитіла або антигени фіксують на нерозчинних носіях: мікропанелях, скляних або нейлонових кульках.

За різних варіантів реакції результати враховують інструментально або візуально.

Виявлення антигенуза схемою «сендвіч» складається з наступних етапів.

Лунки полістиролових мікропанелей сенсибілізують специфічними для шуканого антигену антитілами [2] в концентрації 10. 30 мкг/мл. Зазвичай в лунку вносять по 0,2 мл розчину антитіл у буфері з рН 9,6, витримують при 37 °С 1 год і потім залишають на ніч при 4 °С. , щоб видалити надлишок вільних (несорбованих) антитіл

У лунки вносять по 0,2 мл розчину, що містить досліджуваний антиген, і інкубують при 37°З 2 год, потім панелі знову промивають, як описано раніше.

У лунки вносять по 0,2 мл мічених ферментом специфічних антитіл (кон'югат); панелі інкубують при 37 °С 1. 2год, потім їх відмивають від антитіл, що не зв'язалися.

У лунки вносять 0,2 мл розчину ферментного субстрату [ортофенілендіамін (ОФД) або

5-аміносаліцілова кислота - для пероксидази і р-нітрофенілфосфат - для лужної фосфатази] і інкубують у темряві при 20. 22 ºС 5. 30 хв.

Реакцію зупиняють додаванням 0,05мл 2н. розчину сірчаної кислоти (для пероксидази) та 3 М розчину гідроксиду натрію (для лужної фосфатази).

Облік результатів візуальний або спектрофотометричний щодо збільшення поглинання при довжині хвиль 490 нм (пероксидаза) або 405 нм (лужна фосфатаза). Субстрат ОФД: позитивний результат – оранжево-коричневе фарбування. Субстрат 5-аміносаліцілова кислота: позитивний результат - інтенсивне коричневе фарбування.

За позитивний результатприймають перевищення оптичної щільності дослідних зразків над контрольними у п'ять-шість разів.

Виявлення антитіл(у сироватці крові) засноване на тому ж принципі, але твердофазний носій сенсибілізують відомим антигеном, обробляють досліджуваною сироваткою, потім антивидовим імуноглобуліном, міченим ферментом. Вносять субстрат і за кольоровою реакцією судять про наявність або відсутність антитіл у сироватці крові, що досліджується.

ЗАВДАННЯ ДЛЯ САМОСТІЙНОЇ РОБОТИ

1. Ідентифікувати культури збудників бруцельозу та сальмонельозу прямим МФА.

2. Ідентифікувати двоступінчасту МФА культуру сальмонел.

3. Вивчити мікроскопічну картину при врахуванні результатів гістохімічного ІФА (імунопероксидазний тест).

1. У чому сутність одноступінчастого, двоступінчастого та триступеневого МФА?