Оцінка мікров’язкості клітинних мембран
Оцінка мікров'язкості клітинних мембран - Лекція, розділ Хімія, Флуоресцентна спектроскопія Інтенсивність поглинання світла одиницею об'єму речовини пов'язана з експериментально виміряними величинами відомою формулою Ламберта-Бера.
У попередньому розділі вказувалося, що анізотропія флуоресценції залежить від в'язкості розчину, в якому розчинений флуорофор. Саме ця залежність призвела до використання вимірювання анізотропії для оцінки мікров'язкості в ділянці ацильних бічних ланцюгів клітинних мембран. Вибирають флуорофор, який розподіляється на таке неполярне оточення. Як правило, для цієї мети служать перилен, 9-вінілантрацен, 2-метилантрацен [4, 12] та дифенілгексатрієн [13]. Остання із зазначених речовин найбільше широко використовується в даний час з міркувань, які будуть обговорені нижче. Спочатку вибирають відповідний розчинник порівняння і будують градуювальну криву - залежність виміряних значень анізотропії флуоресценції від відомої в'язкості розчинника порівняння. Типова градуювальна крива наведена на рис. 5.11.
МАЛ. 5.11. Градуювальна крива для оцінки мікров'язкості мембран [12].
Наведено дані щодо анізотропії перилену (1), 2-метилантрацену (2) та 9-вінілантрацену (3) у мінеральній олії.
Потім вимірюють анізотропію флуоресценції для того ж флуорофору, розподіленого в ділянці ацильних бічних ланцюгів ліпідного бислоя. Внутрішня в'язкість бислоя оцінюється порівняно з градуювальної кривою. Для малих ароматичних молекул, мабуть, найбільш ймовірно те, що їх ефективний молекулярний об'єм V буде один і той же розчинник і в ліпідному бісла. В результаті градуювальна крива залежності r від η врозчиннику відомої в'язкості дозволяє зв'язати анізотропію мембранно-пов'язаного флуорофору з мікров'язкістю мембрани.
Типові результати мікров'язкості, отримані при використанні перилену, показані на рис. 5.12. Яєчний фосфатидилхолін є сумішшю ненасичених фосфоліпідів, які не зазнають фазових переходів у вивченому температурному діапазоні. Мікров'язкість, що здається низька (крива 2) і монотонно зростає зі зміною К -1 , Дипальмитоилфосфатидилхолин – насичений фосфоліпід, фазовий перехід якого відбивається в різкому зменшенні мікров'язкості, що спостерігається поблизу 37 ° С (крива 1).
МАЛ. 5.12. Результати визначення мікров'язкості диспергованих фосфоліпідних мембран вимірювання анізотропії перилену [12].
Наведені мікров'язкості для дипальмітоїлфосфатидилхопіну (1), яєчного фосфатидилхоліну (2) і сумішей DPPC + холестерин (3, 4), для яких вказані молярні співвідношення.
Нижче температури переходу ліпідні бислои, які з насичених ліпідів, повинні бути досить в'язкими. На рис. 5.12 також показана уявна мікров'язкість сумішей DPPC + холестерин (криві 3, 4). Холестерин зазвичай збільшує здається мікров'язкість мембран. Для визначення мікров'язкості, наведених на рис. 5.11 для всіх трьох флуорофорів, як розчинник порівняння було застосовано мінеральне масло. Еквівалентні мікров'язкості були отримані для кожної з цих систем, що збільшує достовірність отриманих значень. Однак було б більш бажано використовувати три різні розчинники порівняння, ніж вивчати три різні системи, тому що в цьому випадку експерименти виявили б зв'язок між швидкістю обертання флуорофорів та макроскопічною в'язкістю розчинників [14].
Після цих початкових спостережень виміруАнізотропія флуоресценції стали широко використовуватися для дослідження динаміки мембран. Деякі сприятливі характеристики методу, а саме щодо проста теоретична основа, нескладне та порівняно недороге обладнання та висока чутливість вимірів, сприяли його широкому поширенню. Завдяки високій чутливості з'явилася можливість проведення експериментів у розведених суспензіях мембран, що містять лише слідові кількості зондів. Типове молярне співвідношення ліпід/зонд знаходиться в діапазоні 200:1 - 2000:1, а типова концентрація ліпідів становить 0,1 - 10 мг/мл.
Протягом останнього десятиліття найбільш широко використовуваним зондом для оцінки в'язкості мембран був DPH. Це, мабуть, викликане кількома причинами. У DPH високий коефіцієнт екстинкції (
80000 М-1. см -1 ), що дозволяє досліджувати розведені розчини, а гранична анізотропія стала в діапазоні 320 - 380 нм, що визначає вибір довжини хвилі збудження. Деполяризаційні обертання DPH, мабуть, ізотропні. Обертання навколо довгої осі молекули може бути швидким, але воно не зміщує моменту переходу, і, отже, таке обертання неактивне в деполяризації. (Викривлення, помітні на рис. 5.11 інших зондів, відбуваються частково через анізотропних обертань несиметричних молекул.) І, нарешті, чітко проявляються фазові переходи мембран. Цей факт ілюструє рис. 5.13 на якому наведені мікров'язкості, визначені за допомогою DPH, для фосфоліпідних везикул різного хімічного складу [15]. З отриманих даних видно, що мікров'язкість бислоев, що здається, сильно залежить від їх фазового стану. Цікаво відзначити, що з іншими флуорофорами, такими як 12-антроилоксистеарат, 1-аніліно-8-нафталінсульфонат,N-феніл-1-нафтил-амін, перилен та 9-вінілантрацен, спостерігаються менш різкі зміни.
МАЛ. 5.13. Значення мікров'язкості, що здається, отримані з вимірювань анізотропії DPH [15].
Наведено значення натурального логарифму здається мікров'язкості від зворотної температури для малих одношарових везикул, приготовлених з DOPC (1), DMPC (2), DPPC (3), DSPC (4).
Вочевидь, що виміри анізотропії флуоресценції можуть значно розширити можливості вивчення фізико-хімічних властивостей ліпідних бислоев. Однак важливо зрозуміти та запам'ятати припущення, які були зроблені в оцінці мікров'язкості. Головне з них полягає в тому, що крива градуювання, побудована при використанні ізотропного розчинника порівняння, придатна для флуорофорів, розподілених в анізотропне оточення ліпідних бислоев. Доводиться приймати, що деполяризаційні рухи флуорофору ідентичні у такому різному оточенні. Це припущення було перевірено декількома іншими методами (розд. 6.2.1), і в даний час відомо, що воно некоректне: у ліпідних бислоях дифузійні руху флуорофор зазвичай утруднені, тобто. флуорофори що неспроможні обертатися більше ніж певний кут. В ізотропному розчиннику порівняння подібних кутових обмежень немає. Це не применшує користі вимірювань анізотропії вивчення клітинних мембран, але показує, що треба бути обережним в інтерпретації одержуваних значень мікров'язкості.