Основи спектрофотометрії - Поглинання світла
За спектрами поглинання світла можна:
- ідентифікувати речовину за кількістю смуг, їх становищем, співвідношенням максимумів;
- визначити становище порушених рівнів, тобто. енергії електронних переходів у молекулі хромофора;
- Виміряти концентрацію речовини. ОскількиD = е c l,то для речовини з відомим значенням молярного коефіцієнта поглинанняеmaxвимірювання оптичної щільностіDна довжині хвилі>maxу кюветі із заданою товщиноюl, дозволяє відразу визначити концентрацію хромофораc.Якщо ж молярна екстинкціяеmaxзаздалегідь не відома, то спочатку будують калібрувальний графікD(c) для різних концентрацій речовини, що вивчається, і по ньому знаходять величинуcдля виміряної величиниD.
- Вивчити динаміку хімічної реакції, вимірюючи зміну концентрації якогось із її компонентів у часі.
На цьому побудовано безліч методів аналітичної хімії та біохімії. Якщо вивчається реакції утворюється чи, навпаки, зникає пофарбований, тобто. поглинаючий світло продукт, то за допомогою спектрофотометр можна визначити його концентрацію і простежити за динамікою реакції. Якщо досліджувана речовина не пофарбована, застосовують спеціальні барвники-індикатори, що змінюють поглинання світла при реакції з речовиною, що вивчається. Якщо, наприклад, слід вивчити реакцію:
де речовини А, В і С не поглинають видиме світло, але в результаті взаємодії одного з них, наприклад, речовини з індикатором D утворюється речовина S, поглинає світло:
Розділ 1.01 + D S,
вимірюючи його оптичну щільність, можна визначити концентрації речовин А, В і С, які лінійно пов'язані з D і S.
Успектрофотометрі- прилад дляреєстрації спектрів поглинання речовини - фотоприймачем безпосередньо вимірюється інтенсивність світлаI, що пройшов через зразок. Порівнюючи її з інтенсивністю світла, що пройшло через кювету з розчинником(I0),можна визначити коефіцієнти пропускання та поглинання світла:T = I/Ioім = 1 - T.Однак, зручно вимірювати не пропусканняТ, а оптичну щільністьD, яка, на відміну відТ, є адитивною величиною: оптична щільністьDУсуміші з декількох хромофорів , тобто. речовин, що поглинають світло, дорівнює сумі оптичних щільностей окремих хромофорівDi:
Спектри поглинання світла найважливіших біомолекул. А. ДНК (1 - дволанцюжкова ДНК; 2 - ДНК, денатурована нагріванням; 3 - суміш нуклеотидів. Б - білок (сироватковий альбумін людини. В-зоровий білок родопсин. Г - нікотинамідаденіндінуклеотид, окислена і відновлена форми: NAD + і NADH. Д - розчин хлорофілу в ефірі (1 - хлорофіла; 2 - хлорофілb. Е - флавінаденіндинуклеотид (флавінаденінмононуклеотид), окислена і відновлена форми: FAD (FMN) і FADH2 (FMNH2). Ж - гем у складі цитохрому с, окислена і відновлена форми, показані основні смуги: , і
Тому, віднімаючи оптичну густину кювети з розчинником із загальної оптичної густини розчину, можна визначити оптичну густину самого хромофора. Для цього в спектрофотометрах є логарифмічний блок, що перетворює фотострум приймача світла, пропорційнийI, пропорційний сигналD:
У старих спектрофотометрах цю функцію виконував спеціальний електронний пристрій, а зараз вирішують комп'ютерними засобами.
Прилади для вивчення спектрів поглинання світланазиваютьсяспектрофотометрами.Вони поділяються на однопроменеві та двопроменеві. В однопроменевому спектрофотометрі (Рис. 4А) світло від ксенонової лампи, що випромінює, на відміну від ламп розжарювання, не тільки видиме, але і ультрафіолетове світло, проходить через монохроматор, який розкладає світло в спектр, з якого за допомогою вузької щілини виділяє спектральну смугу шириною порядку одного чи кількох нанометрів. Для цього використовуються диспергуючі елементи - кварцові призми або, в сучасних приладах, дифракційні грати, що розкладають біле світло у спектр. Дифракційні решітки відрізняються лінійною залежністю кута відхилення променя і незалежністю лінійної дисперсії від довжини хвилі, більшою світлосилою і більшою зворотною лінійною дисперсією (0,1-1,0 нм/мм) порівняно з призмами (1-10 нм/мм), і, нарешті, вони дешевші. Однак, в ультрафіолетовій області у них вищий рівень розсіяного світла. Тому в ультрафіолетовому діапазоні іноді виправдане застосування призмінних монохроматорів.
Схема однопроменевого (А), двопроменевого (Б) та двохвильового (В) спектрофотометрів. Л – лампа; М – монохроматор; К – кювети; У - підсилювач; Ком - комп'ютер; П – принтер. (По: Володимиров, Потапенко, 2006)
Влаштування спектрофотометра USB4000 фірми Ocean Optics. А – універсальний спектрометр. Б – схема вимірювань. 1 - конектор для підключення оптичного волокна; 2 - вхідна щілина шириною від 5 до 200 мкм, що регулює інтенсивність вхідного світлового потоку; 3 - довгохвильовий світлофільтр, що відсікає короткохвильове випромінювання, якщо воно не потрібно для вимірювань (в інших випадках він забирається); 4 - колімуючі увігнуте дзеркало, що формує паралельний світловий пучок; 5 - дифракційні грати, що розкладає світло в спектр; 6 - фокусуючеДзеркало; 7 - циліндрична лінза, що збирає, фокусує світло на лінійний детектор; 8 - лінійка з 3648 CCD елементів, кожен з яких (піксел) реєструє світло з певною довжиною хвилі
Для більш точного виділення монохроматичного світла з певною довжиною хвилі застосовують подвійні монохроматори, в яких виділене вузькосмугове світло додатково розкладається другою призмою або ґратами. Якщо потрібно вивчити тонку структуру спектра з максимальною спектральною роздільною здатністю, то встановлюється мінімальна ширина щілини, зазвичай 0,5-1 нм. Але при цьому зменшується світловий потік і потрібна максимальна чутливість фотоприймача. Якщо не потрібна така висока спектральна роздільна здатність, то ширину щілини збільшують до 2-5 нм, що суттєво знижує вимоги до чутливості фотоприймача. Фотоприймач реєструє світло, що пройшло через кювету із зразком. Він перетворює світлову енергію в електричний струм, пропорційний інтенсивності проходить світла. Далі відбувається посилення електричного сигналу, логарифмічне перетворення та реєстрація за допомогою самописця чи комп'ютера.
Фотоприймачем зазвичай служить фотоелектронний помножувач (ФЕУ) або в деяких сучасних приладах лінійка фотодіодів або CCD елементів (Рис. 5А) ФЕУ - найбільш чутливий фотоприймач, здатний реєструвати навіть поодинокі фотони, але він значно дорожчий і вимагає високовольтного живлення (700-3000 В), що ускладнює та подорожчає прилад. Використовуючи лінійку CCD елементів, кожен з яких налаштований на певну довжину хвилі, можна відразу зареєструвати весь спектр і обійтися без дорогої механіки, що керує рухом щілини, що виділяє монохроматичне світло.
При спектрофотометричних вимірах спочатку реєструють фотострум, що пройшов черезконтрольну кювету із розчинником. Ці показання перетворюються на величину, пропорційну оптичній щільностіD0, і запам'ятовуються комп'ютером. Потім реєструється фотострум, що пройшов через ту ж кювету, в яку доданий досліджуваний розчин. Після логарифмічного перетворення сигналу та відніманняD0знаходять чисту оптичну щільність доданої речовини:Dв= D1-D0. Переваги однопроменевого спектрофотометра - простота і дешевизна, а недоліки - нестабільність випромінювання лампи, шуми приймача світла, що знижує чутливість приладу. Зазвичай чутливість однопроменевих спектрофотометрів близько 10 -3D.
Як приклад сучасного спектрофотометра наведемо пристрій USB4000 фірми Ocean Optics (Мал. 5). У ньому використовується багатоцільовий волоконно-оптичний спектрометр з дифракційними гратами та лінійкою з 3648 CCD елементів. Особливість приладу в тому, що світло розкладається у спектр не до, а після проходження зразка. Це дозволяє використовувати спектрометр як дешевий та мініатюрний (розміром всього 15х5 см) універсальний модуль, придатний як для спектрофотометричних, так і для спектрофлуорометричних вимірів. Волоконна оптика дозволяє вимірювати спектри віддалених зразків.
Більш чутливі диференціальні спектрофотометри, в яких реєструється не абсолютна величина оптичної густини, а різниця в оптичній густині або двох зразків або одного і того ж зразка при певній зміні спектра, викликаному хімічною модифікацією, впливом зовнішнього фактора або функціонуванням даної молекули. У двопроменевому спектрофотометрі (Рис. 4Б) промінь від лампи після монохроматора розщеплюється на два за допомогою обтюратора - дзеркала, що обертається, розташованого під кутом 45 ощодо спрямування променя. Це дзеркало має такі вирізи, що половину часу монохроматичний промінь проходить через них перший зразок, а другу половину відбивається дзеркалом інше дзеркало і йде через другий зразок. Фотоприймач поперемінно вловлює світло, що пройшло через одну кювету, то через другу. Оптичні густини, виміряні в кожному каналі, порівнюються, і реєструється їх різниця:ДD = D1- DЦей метод дозволяє вимірювати малі зміни оптичної густини до 10 - 4Dі натомість загального великого поглинання. Його недолік - складність та вища вартість приладу.
Двохвильовий спектрофотометр використовується для вивчення зразків, що сильно розсіюють світло, наприклад клітинних суспензій. Релеєвське світлорозсіювання сильно зростає в ультрафіолетовій області і його внесок у світло, що реєструється, стає порівнянним із внеском поглинання світла (відрізок 1). Для того щоб відняти цю компоненту, у двохвильовому спектрофотометрі світло від лампи розщеплюється на два промені і проходить через два монохроматори, що виділяють дві близькі довжини хвиліл1іл2, одна з яких відповідає досліджуваному максимуму, а друга розташована біля його підніжжя. На хвиліл1ми реєструємо суму поглинання світла (відрізок 1 на Рис. 6) та розсіювання (відрізки 2+3), а на хвиліл2- лише розсіювання (3). Розмір світлорозсіювання у цих близьких точках відрізняється порівняно невелику величину (відрізок 2 на рис. 6). Тому віднімання інтенсивності світла, що реєструється в одному каналі, від інтенсивності світла в іншому каналі дозволяє майже повністю виключити цю компоненту:
А оскільки прил2інтенсивність поглиненого світла невелика:Iпогл(л2)0, арозсіювання відрізняється на невелику величину:Iрас(л1) Iрас(л2)то ми практично вимірюємо інтенсивність світла в максимумі поглинання. Відносна помилка вимірів (2)/(1) значно зменшилася порівняно з початковою: (2+3)/(1), де у дужках наведено висоти відповідних відрізків на Мал. 9. Двохвильові спектрофотометри також дозволяють знизити перешкоди, пов'язані динамічними змінами світлорозсіювання внаслідок осідання або рухливості біооб'єктів. Вони зручні для кінетичних вимірювань, наприклад, для вивчення процесів електронного транспорту в мітохондріях або цілих клітинах. Двохвильовий спектрофотометр - дуже точний прилад, але складний і дорогий, тому що в ньому використовуються два монохроматори.
Для дослідження швидкоплинних фотопроцесів використовуються методи імпульсної спектроскопії. Вони були розроблені у 1950-х роках та отримали назву фдеш-фотолізу. Суть його полягає в дослідженні короткоживучих проміжних фотопродуктів (інтермедіатів), що утворюються при дії короткочасного потужного спалаху світла (flash), за допомогою наступного вимірювання кінетики зміни поглинання світла на певній довжині хвилі, спектрів поглинання або флуоресценції цих фотопродуктів через певний проміжок. дуже коротким). Для збудження молекул використовують імпульсні лампи (тривалість спалаху порядку мікросекунд) або імпульсні лазери, що дають нано-, пико-і навіть фемтосекундні (10 -8 - 10 -13 с) імпульси. Як зондуючий імпульс, що використовується для реєстрації поглинання світла, використовують слабкіший спалах світла або лазерний імпульс. Він не повинен викликати фотоперетворень біологічного об'єкта, але бути достатнім для надійної реєстрації спектральних змін.
Необхідно пам'ятати, що приD2 настає насичення і прилад не може правильно виміряти цю величину. Згідно з Володимировим та Потапенком (2006), найменша похибка вимірювань оптичної щільності досягається в інтервалі 0,2 - 0,8. Тому якщо розчин хромофора надто оптично щільний, його необхідно розбавляти так, щоб вимірювана величинаDпотрапляла в цей інтервал. Якщо величина D недостатня, то доцільно взяти кювету з більшою товщиною, або збільшити інтенсивність падаючого світла, збільшивши ширину щілини.
У деяких випадках закон Бугера-Ламберта-Бера може порушуватися:
- при використанні немонохроматичного світла залежністьD(с)стає нелінійною;
- при суттєвому світлорозсіюванні зразка, такого як, наприклад, клітинна суспензія, величина оптичної щільностіDв ультрафіолетовій області завищуватиметься, оскільки вимірюване ослаблення світла складатиметься не тільки з поглинання, але і розсіювання;
- при сильній люмінесценції зразка, фотони, що випускаються, можуть потрапляти у фотоприймач, занижуючи величинуD.
- при нерівномірному розподілі хромофора, наприклад, у вигляді окремих гранул, що часто відбувається при агрегації молекул, оптична щільність розчину буде нижчою, ніж у разі гомогенного розподілу (ефект сита).