Призначення, Контент-платформа
ІФА набір АКТГ призначений для кількісного визначення АКТГ (Адренокортикотропного гормону) у плазмі людини. Для діагностикиinvitro.
DRG Intl ACTH ELISA [твердофазний імуноферментний аналіз] для вимірювання біологічно активного АКТГ (39 амонокислотного ланцюга). Овече поліклональне антитіло до АКТГ людини, очищене методом афінної хроматографії, і мишаче моноклональне антитіло до АКТГ людини є специфічними до ділянок молекули АКТГ, що добре визначаються. Одне антитіло зв'язується тільки з С – кінцевою частиною АКТГ 34-39, воно біотиноване. Інше антитіло зв'язується тільки із середніми ділянками та N-кінцевою частиною ACTH 1-24, воно має мітку пероксидази хрону для виявлення .
В ході аналізу калібратори, контролі та зразки пацієнта одночасно інкубуються з антитілом з ферментною міткою та біотинованим антитілом у лунках покритих стрептавідином. Після інкубації мікролунки промиваються для видалення незв'язаних компонентів і фермент, пов'язаний з твердою фазою, інкубується з субстратом ТМБ (tetramethylbenzidine). Реакція зупиняється додаванням стоп-розчину на основі кислоти та забарвлення вмісту лунок змінюється. Інтенсивність жовтого фарбування прямо пропорційна концентрації АКТГ у зразку. Будується крива залежності концентрації від одиниць абсорбції за наслідками, отриманими при вимірюванні калібраторів. Концентрації вихідного АКТГ контролів та зразків пацієнтів визначаються за цією кривою.
біотиноване антитіло до АКТГ (афінної очистки овечі антитіла до АКТГ)
антитіла до АКТГ з міткою пероксидази хрону (мишачі моноклональні антитіла до АКТГ)
промивний концентрат (сольовий розчин з ПАР)
один тримач зі стрипами, покритимистрептавідином
12 стрипів по 8 лунок
ліофілізований (крім нульового калібратора) синтетичний
h-АКТГ. Нульовий калібратор (БСА/розчин кінської сироватки) у рідкій формі, готовий до використання. Всі інші калібратори складаються із синтетичного АКТГ (1-39) у розчині БСА/кінської сироватки.
Прим.: точні концентрації вказані на етикетках флаконів
ліофілізовані. 2 рівні. Синтетичний h-АКТГ (1-39) у розчині БСА/кінської сироватки
Прим.: точний діапазон вказаний на етикетках флаконів
1 х 2мл на рівень
Додатково необхідні компоненти:
• автомат для промивання лунок [якщо немає в наявності, прийнятне промивання вручну)
• прецизійні піпетки на 25, 100 та 150 µ L .
•(опційно): багатоканальна піпетка на50, 100 та 150 µ L .
Попередження та запобіжні заходи для користувачів:
Реагенти набору містять компонентів людської крові. Зі зразками пацієнтів, які можуть мати позитивну реакцію на поверхневий антиген гепатиту В, HBcAg або антитіла до ВІЛ, необхідно поводитися як з потенційно біологічно небезпечними. Необхідно дотримуватися звичайних запобіжних заходів при роботі з нетестованими зразками.
Стоп-розчин складається з 1 N сірчаної кислоти. Це сильна кислота. Поводитися з обережністю, щоб уникнути опіків (використовувати рукавички та захист для очей). У разі розливання негайно змити велику кількість води. Чи не вдихати випаровування!
Забір та зберігання проб.
Визначення АКТГ має виконуватися з використанням плазми EDTA. Для парного дослідження проб потрібно 400 мкл Е DTA плазми. Відібрати цілісну кров у лавандову (ЕДТА) трубку. Необхідно належним чином відокремитиплазму, переважно в центрифузі, що охолоджується. Зберігати при -20 ° C або нижче. Зразки сироватки можуть зберігатися до 8 годин при 2-8°C. Зразки плазми EDTA (-20 ° C) стабільні до 4 міс.
Підготовка реагентів та їх зберігання.
1. Зберігати всі компоненти набору при 2-8 ° C за винятком концентрату для промивання та стоп-розчину після отримання перед використанням.
Всі реагенти, окрім ненульових калібраторів, контролі та промивний концентрат готові до використання.
Зберігати всі реагенти при 2-8 ° C, крім промивного концентрату, який потрібно зберігати при кімнатній температурі до розведення, щоб уникнути появи осаду.
2. Для кожного ненульового калібратора (калібратори B - F ) і контролів 1 і 2, відновити кожен флакон, додавши 2 мл дистильованої та деіонізованої води і змішати. Дати відстоятися 10 хвилин, потім ретельно перемішати до відновлення.Використовувати калібратори та контролі негайно після відновлення. Калібратори, що залишилися, і контролі заморозити (-20oC) якнайшвидше після використання. Стандарти та контролі стабільні при -20°C 6
тижнів після відновлення. Допускається до 3 розморожувань за умови поводження з реагентами згідно з інструкціями у п. «Зауваження щодо проведення аналізу».
3. Реагент A: промивний концентрат: ретельно перемішати вміст флакона. За наявності осаду в концентрації, що промиває, внаслідок тривалого зберігання при низькій температурі, напр. 4 ° C, розчинити осад на водяній бані при температурі 37 ° C або в сушильній шафі при постійному помішуванні. Додати в промивний концентрат (30 мл мл дистильованої або деіонізованої води і перемішати. Розведений робочий промивний розчин стабільний 90 днів прикімнатної температури.
1. Помістити в тримач кількість лунок зі стрептавідином необхідну для використання всіх (6) АКТГ калібраторів, A – F калібраторів АКТГ [точні концентрації вказані на етикетці флакона], контрольних плазм, зразків пацієнтів.
2. Розкопати 200 мкл проб у помічені лунки. Заморозити (-20 o C ) калібратори, що залишилися, і контролі якомога швидше після використання.
3. Додати 25 мкл реагенту 1 (біотіноване антитіло) у кожну лунку з пробою.
4. Додати 25 мкл реагенту 2 (антитіло з ферментною міткою) у ті ж лунки. Накрити планшету алюмінієвою фольгою або піддоном, щоб запобігти влученню світла, помістити в орбітальний шейкер (170+10 об/хв) на 4 години + 30 хвилин за кімнатної температури (22°-28°C).
5. Спочатку аспірувати рідину, потім промити кожну лунку 5 разів робочим розчином для промивання (приготовленим з реагенту А), використовуючи автомат для промивання лунок. Видалити залишки вологи, поклавши планшету на поглинаючий матеріал. Об'єм розчину для промивання повинен бути достатнім для використання 0.35 мл на кожну лунку.
6. Додати 150 мкл реагенту B (TMB субстрату) у кожну лунку.
7. Уникаючи потрапляння світла, помістити планшети в орбітальний шейкер при 170+10 об/хв на 30+5 хвилин за кімнатної температури. (22 ° -28 ° C).
8. Додати 100 мкл стоп-розчину у кожну лунку. Обережно перемішати.
9. Вважати абсорбцію розчину в лунках протягом 10 хвилин, за допомогою мікропланшетного ридера, встановленого на 450 нм проти 250 мкл дистильованої або деіонізованої води. Зчитувати лунки знову при 405 нм проти дистильованої або деіонізованої води.
Примітка:друге зчитування розраховане на те, щоб розширитикалібрувальну криву значення максимального калібратора, прибл. 500 pg/mL. Отже, значення зразків пацієнтів із АКТГ > 150 pg/mL можуть бути визначені за калібрувальною кривою побудованою за результатами зчитувань аж до концентрації еквівалентної максимальному калібратору при зчитуванні на 405 нм, без врахування довжини хвилі максимальної абсорбції.
Проби та контролі необхідно зчитувати при 450 нм для концентрацій АКТГ до 150 pg/mL. Концентрації АКТГ вище 150 pg/mL повинні інтерполюватись при зчитуванні на 405 нм.
10. Використовуючи підсумкові значення абсорбції, отримані на попередньому етапі, побудувати калібрувальну криву за способом кубічного сплайну -, 4 параметрової логістики, або поточкової інтерполяції для обчислення концентрації АКТГ.
Зауваження щодо проведення аналізу.
• АКТГ 1-39 – вкрай нестабільна молекула. Проводити дослідження необхідно відразу після відновлення або відтавання всіх калібраторів, контролів та зразків пацієнтів.
• Зразки необхідно піпетувати в лунки, не допускаючи появи бульбашок повітря. Для цього
потрібно використовувати «зворотну піпетку» згідно з інструкцією виробника піпеток.
• Про зразки пацієнтів зі значеннями, що перевищують максимальний калібратор (F), прибл. 5 00 pg/mL (точна концентрація вказана на етикетці флакона), можуть бути розведені калібратором А (нульовим) та досліджені повторно. Результат помножити на коефіцієнт розведення.
• Неможливе використання реагентів з різних лотів.
• При необхідності змішайте рівні обсяги, достатні для проведення дослідження, реагентів 1 (біотіноване антитіло) та 2 (антитіло з ферментною міткою) у чистому жовтому флаконі, потім додати 50 µ L змішаних антитіл у кожну лунку. Цідії замінюють етап (3) і (4), потім інкубація в орбітальному шейкері.
Графік послідовності операцій під час проведення дослідження
1. За результатами зчитування при 450 nm, побудувати калібрувальну криву використовуючи перші п'ять калібраторів: калібратори A, B, C, D та E.
За результатами зчитувань при 405 nm побудувати другу калібрувальну криву використовуючи три калібратори з найвищими концентраціями, тобто калібратори D, E і F.
2. Приписати концентрацію, вказану на флаконі, кожному калібратору, у pg/mL. Нанести дані калібрувальної кривої на міліметровий папір з концентрацією на осі X-і відповідної абсорбції на осі Y.
3. З'єднати прямі дві сусідні точки. Цей математичний алгоритм називається поточковим розрахунком.
Концентрацію зразка можна отримати, відклавши значення абсорбції осі Y і знайшовши відповідну концентрацію на осі X .
Зразки пацієнтів та контролів слід зчитувати при довжині хвилі 450 nm для концентрацій ПТГ до 200 pg/mL. Концентрації ПТГ більше 150 pg/mL повинні інтерполюватися, використовуючи дані зчитування при 405 nm.
Комп'ютерні програми, що використовують кубічний сплайн або 4 PL [4 – параметрова логістика], можуть також застосовуватися.
(Дані зразків пацієнта при 450 нм (зчитування абсорбції порівняно з дистильованою або деіонізованою водою))
концентрація > 150 pg / mL, рекомендується використовувати дані отримані при 405нм, див. нижче в таблиці Sample Data at 405 nm.
Для зразків з результатами pg/ml рекомендується використовувати дані, отримані при
довжині хвилі 450нм, див. графу "Sample Data at 450 nm" у таблиці. Це забезпечить результати за оптимальноїчутливість набору.
Дані представлені лише як ілюстрації і не повинні використовуватися замість даних, отриманих під час дослідження.
контрольна плазма повинна досліджуватись при кожному дослідженні калібраторів та зразків пацієнтів.
Результати дослідження контрольних зразків на прийнятність слід оцінювати з використанням відповідних статистичних методів. Якщо при дослідженні результати контрольних зразків знаходяться поза допустимим діапазоном, результати зразків пацієнтів можуть бути недійсними.
Набір PTH ELISA не показав ефекту гака високої дози при дослідженні зразків з 20,000 pg / mL АКТГ. Зразки з рівнями АКТГ вище максимального калібратора повинні бути розведені та досліджені повторно.
У 83 пацієнтів (США) було виміряно рівень АКТГ з використанням набору Sangui ACTH ELISA. Отримані значення були в межах від 7.9 до 66.1 pg/mL. Середнє геометричне + 2 стандартні відхилення середнього = 8.3 to 57.8 pg/mL.
Були проаналізовані 117 зразків пацієнтів, рівні АКТГ у межах від 1.5 до 1045 pg/mL за допомогою ДРГ ELISA та набору для імунорадіометричного аналізу Nichols IRMA ACTH. Отримано наступну статистику (лінійна регресія):
або мінімальний рівень даного набору визначається за найменшим окремим значенням,
не дорівнює нулю, при довірчій межі 95%. Чутливість DRG ACTH ELISA = 0.46 pg/mL.
Прецизійність і відтворюваність.
Прецизійність (варіації інтра-аналізу) набору DRG Intl ACTH ELISA розраховувалася за визначенням 21 реплікату кожного з двох зразків.
Загальна прецизійність (варіація інтер-аналізу) DRG Intl ACTH ELISA наборурозраховувалася за даними двох зразків, отриманих при 35 різних дослідженнях, трьома фахівцями із трьома різними лотами реагентів за період 9 тижнів.
Специфічність та Крос-реактивність
Крос-реактивність АКТГ була вивчена при додаванні різних речовин до стандарту АКТГ:
Різні кількості АКТГ були додані до плазми чотирьох пацієнтів:
У результаті дослідження кінетичного ефекту був помічено значного зсуву даних:
Лінійність розведень зразків пацієнта: Паралелізм
5 зразків плазми пацієнтів було розведено калібратором A (нульовим). Результати в pg/mL: