Спосіб флуоресцентного гістологічного виявлення амілоїду
Власники патенту UA 2611408:
а фарбування здійснюють 1,5% спиртовим розчином барвника, змішаним з 1% водним розчином гідроксиду натрію у співвідношенні 1:1. Винахід забезпечує підвищення інформативності за рахунок збільшеної контрастності рельєфу поверхні та сприяє більшій безпеці гістологічних зрізів. 3 табл., 2 іл., 1 ін.
Винахід відноситься до експериментальної біології та медицини і призначене для дослідження поза- та внутрішньоклітинної локалізації амілоїду в тканинах, а також рідких середовищах.
Відомий флуоресцентний спосіб виявлення розчинених у воді фібрил амілоїду за допомогою бензантрону (3-морфоліно-7Н-бензо[de]антрацен-7-он) (Gorbenko G., Trusova V., Kirilova Ε., Kirilov G., Kalnina I., Vasilev Α., Kaloyanova S., Deligeorgiev T. Нові fluorescent проби для виявлення і характеристики амілоіду фібрилів // Chemical Physics Letters. - 2010. - Vol. 495. - P. 275-279).
Недоліками цього способу є те, що цей препарат не апробований на гістологічних зрізах, не виробляється у промислових масштабах для лабораторного використання та не ліцензований. Як антраценове похідне 3-морфоліно-7Н-бензо[de]антрацен-7-він можливо є канцерогеном, що виключає можливість його використання як лікарського засобу.
Відомий спосіб гістохімічного визначення амілоїду за допомогою барвника Конго червоний [Н.Н. Benhold (1923), в кн.: Ліллі Р. Патогістологічна техніка та практична гістохімія. М.: Світ, 1969. 646 з]. Недоліком цього способу є низька інформативність, що полягає у відсутності можливості отримання кількісного результату.
Найбільш близьким за технічною сутністю і результатом, що досягається, є діагностичний спосібфлуоресцентного виявлення амілоїду в гістологічних зрізах органів людей, померлих від амілоїдозу, за допомогою фарбування зрізів тіофлавіном Т, або S (Bums J., Pennock C.A., Steward PJ). - 1967. - Vol. 94. - P. 337; Bancroft J.D., Stevens A. Theory and practice of histological techniques Ed. 2 / Churchill Livingstone. - Edinburgh & London; парафінові зрізи органів, зафіксовані в 10% формаліні, попередньо забарвлюють залізним гематоксиліном, після чого дофарбовують 1% розчином тіофлавіну S або S.
Дофарбовані зрізи підкислюють у розчині лимонної кислоти, висушують, закладають у прозорі нефлуоресціюючі середовища та мікроскопують на флуоресцентному мікроскопі. При фарбуванні тіофлавіном Τ амілоїд виглядає як зелено-коричневі флуоресціюючі об'єкти (малюнки 1а, 1б). Наприклад, на рис. 1а зображено світіння амілоїдних депозитів, розташованих у клубочку (Кл), канальцях (Кн) та цитоплазмі епітелію канальців (Е) (об'єктив 40 х ), а на рис. 1б - свічення амілоїдних депозитів у клубочку, після фарбування тіофлавіном Т.
На препаратах нирки амілоїдні депозити у просвіті канальців та розчинені в цитоплазмі епітелію канальців виглядають як яскраво-зелені практично однорідні об'єкти. У стінках судин і між капілярними петлями ниркових клубочків амілоїд світиться менш інтенсивно коричневим відтінком. Ділянки тканин, що не містять амілоїд, виглядають темно-зеленими, практично чорними. Клітинні ядра диференціюються як округлі об'єкти, що не світяться.
При вимірюваннях інтенсивності світіння за допомогою фотопомножувача максимум флуоресценції тіофлавіну припадав на 534 нм.Інтенсивність світіння інтактних і уражених амілоїдом тканин наведена в таблиці 1. Високий розмах варіаційного ряду свідчить про те, що інтенсивність флуоресценції амілоїду, міченого тіофлавіном, значно різниться в різних ділянках тканини нирки, що може свідчити про наявність концентрації.
Цей спосіб використовується для виявлення амілоїду в біологічних середовищах (плазма крові, спинно-мозкова рідина) хворих людей, а також вивчення амілоїду in vitro, як виділеного з тканин хворих людей або тварин, так і штучно приготованих з білків-амілоїдогенів (Козлов В.). А., Сапожніков С.П., Шептухіна А.І., Голенков А.В., Порівняльний аналіз різних моделей амілоїдозу // Вісник української академії медичних наук - 2015. - № 1. - С. 5-11; І., Волова Є.А., Комісарчик Я.Ю., Снігурівська Є.С., Маскевич Α.Α., Дробченко Є.А., Кузнєцова І.М., Туроверов К.К. основі інсуліну // Цитологія.- 2013. - Ν 11. - С.809-814).
Недоліком даного способу є дорожнеча тіофлавінів (вартість 25 г становить 3318,16 руб., http://www.zymophore.ru/), вони не виробляються в Україні та закуповуються за кордоном.
Завданням винаходу є розширення асортименту препаратів з властивостями фарбування гістологічних зрізів для оцінки інтенсивності амілоїдогенезу, які можуть замінити дорогий тіофлавін.
Технічний результат - підвищення економічності з допомогою зниженої вартості препаратів, інформативності з допомогою збільшеної контрастності рельєфу поверхні.
де Y=2-NO2, 3-NO2, 4-NO2, 3-COOH, 4-COOH, а фарбування здійснюють 1,5% спиртовим розчином барвника, змішаним з 1% водним розчином гідроксиду натріюу співвідношенні 1:1.
Сутність способу флуоресцентного гістологічного виявлення амілоїду полягає у наступному.
Синтез досліджуваних речовин (1a-д) здійснювали взаємодією легкодоступних N-арил-2,5-дигідропіррол-2,5-діонів з фуран-2-карбальдегід при еквімольному співвідношенні реагентів при кімнатній температурі. Як розчинник використовували абсолютний 1,4-діоксан. Чистоту синтезованих продуктів контролювали за даними тонкошарова хроматографії, а структуру підтверджували методами ІЧ, ЯМР 1 Н-спектроскопії.
З'єднання (1a-д) є кристалічними речовинами світло-жовтого або помаранчевого кольору, константи і дані елементного аналізу яких наведені в таблиці №2.
Флуоресцентні властивості апробованих речовин (1a-д), що мають, подібно до тіофлавіну Т, будову молекулярного ротора, в сухому кристалічному вигляді виявлялися при збудженні ультрафіолетом у видимому діапазоні 421-435,5 нм. Ні спиртової, ні водно-спиртової розчини цих речовин в діапазоні концентрацій від 0,75% до 1,5% флуоресценції, що реєструється за допомогою ФЕУ-39, не виявляли.
Приклади виконання способу.
Експерименти проведені на 5 мкм парафінових зрізах нирок людини з раніше клінічно встановленим та гістологічно підтвердженим діагнозом амілоїдозу. Знеособлені препарати надані «Республіканським бюро судово-медичної експертизи», м. Чебоксари. Депарафіновані зрізи були попередньо пофарбовані гематоксиліном, а потім протягом 3 хв додатково оброблені водно-спиртовими розчинами будь-якого з похідних 4-N-арил-3,5-діоксо-1-форміл-10-окса-4-азатрицикло-[5.2.1 1.7.0 2.6] дец-8-єнов формули (1а-д). Водноспиртові розчини були отримані наступним шляхом. Спочатку сполуки формули (1а-д)розчиняли в 96% спирті з одержанням спиртового розчину 1,5% концентрації, а потім до отриманого розчину додавали 1% водний розчин гідроксиду натрію у співвідношенні 1:1 за обсягом. Кінцева концентрація препаратів (1а-д) в отриманому водно-спиртовому розчині становила 0,75%, а середовище такого розчину лужне (рН 7). Після фарбування зрізи були промиті водою, зневоднені та загорнуті в полістирол.
Мікроскопію зрізів здійснювали на мікроскопі "Люмам-4". Флуориметрію здійснювали за допомогою мікролюмініметра ФМЕЛ-1А, замикаючий світлофільтр ЖС18, λвозбужд.=410 нм, світлофільтри ФС, БС, СЗС. Електричні параметри всіх вимірах визначалися такими параметрами: вхідна напруга 900 В, опір підсилювача 10 6 Ом. У насадці було встановлено зонд 0,5. Для вимірювання використовували ФЕУ-39, показання знімали з цифрового вольтметра, дані представлені в мілівольтах (мВ). Мікрофотографії отримані цифровою камерою Levenhuk С800 NG 8М, USB 2.0.
На фарбованих препаратах максимум флуоресценції спостерігався при 534 нм.
Після обробки парафінових зрізів амілоїдної нирки підлуженими водно-спиртовими розчинами всіх досліджуваних речовин структури (1a-д) спостерігалося інтенсивне зелене свічення амілоїдних депозитів, розташованих у канальцевих структурах (малюнки 2а-2д, об'єктив 40 х). Наприклад, на рис. 2а зображено світіння амілоїдних депозитів, розташованих у канальцевих структурах, після фарбування препаратом (1а); на рис. 2г зображено свічення амілоїдних депозитів, розташованих у канальцях, після фарбування препаратом (1г); на рис. 2д зображено свічення амілоїдних депозитів, розташованих у канальцях, після фарбування препаратом (1д).
Найменше за інтенсивністю світіння виявлялося в клубочках з парієтальним, що добре виявляється.листком капсули та темно-зеленими депозитами амілоїду, розташованими між петель клубочка, епітелію канальців та ендотелією артеріол. Наприклад, на рис. 2а 1 зображено світіння амілоїдних депозитів, розташованих у клубочках, після фарбування препаратом (1а); на рис. 2б зображено світіння амілоїдних депозитів, розташованих у клубочках, після фарбування препаратом (1б); на рис. 2в зображено свічення амілоїдних депозитів, розташованих у клубочках, після фарбування препаратом (1в).
Виявлене свічення рівномірно розташовувалося в цитоплазмі клітин. Клітинні ядра виглядали як темні нефлуоресціюючі овальні об'єкти. Інтенсивність флуоресценції депозитів у канальцях відрізняється на порядок, що може бути обумовлено кількісними відмінностями вмісту амілоїду на різних ділянках зрізів (таблиця 3).
Як випливає з даних, поданих у таблиці, інтенсивність флуоресценції досліджуваних препаратів (1а-д) не відрізняється, що пояснюється близькістю їх хімічної будови.
При застосуванні сполук (1а-д) порівняно з забарвленням тіофлавіном Т збільшується інформативність забарвлення за рахунок збільшеної контрастності рельєфу поверхні. Крім того, при фарбуванні тіофлавін необхідна інкубація зрізів в 1% розчині лимонної кислоти, що необхідно для збудження флуоресценції тіофлавіну. Тоді як у заявленому способі фарбування необхідності такої обробки немає. Оскільки рН розчинів барвників, які готуються за заявленим способом, має лужну реакцію, він більш фізіологічний, оскільки нативні (живі) тканини мають рН≥7,37 (Березов Т.Т., Коровкін Б.Ф. Біологічна хімія: Підручник / Під. редакції АМН СРСР С. С. Дебова - 2-ге вид., переробки і доп. ). Цеобставина повинна сприяти більшій безпеці гістологічних зрізів, ніж при їх обробці кислотами.
Заявлений спосіб дозволяє селективно локалізувати амілоїд як вільно розташований у міжклітинному просторі, так і внутрішньоклітинно, а також у рідких середовищах і може бути використаний у судово-медичній експертизі, клінічній діагностиці амілоїдозу, експериментальній біології та медицині.
а фарбування здійснюють 1,5% спиртовим розчином барвника, змішаним з 1% водним розчином гідроксиду натрію у співвідношенні 1:1.