Спосіб отримання імуноглобулінового препарату
Винахід відноситься до медицини та медичної промисловості, а саме до виробництва препаратів для імунотерапії та імунопрофілактики бактеріальних та вірусних захворювань. Сутність способу: плазму крові фракціонують етиловим спиртом при низькій температурі, виділяють осад, що містить імуноглобуліни, розводять у розчині хлориду натрію, виділяють осад протромбіну центрифугуванням, встановлюють рН отриманого супернатанту рівним 5,30,05,1 додають етил одночасному зниженні температури до (-5) - (-6) o З видаляють баластний осад Б центрифугуванням, встановлюють рН отриманого супернатанту 5,9-6,0, додають ДЕАЕ - сефадекс з розрахунку 6-10 мл на літр розчину, інкубують розчин протягом 1-5 год, видаляють ДЕАЕ-сефадекс фільтрацією, одержують осад цільового продукту спиртовим осадженням, розчиняють осад у фізіологічному розчині, додають глікокол і проводять стерилізуючу фільтрацію. Технічний результат: одержують препарат імуноглобуліну G високого ступеня очищення, що знижує побічні реакції при застосуванні його у пацієнтів.
Винахід відноситься до медицини, зокрема до імунології, і може бути використане для імунотерапії та імунопрофілактики бактеріальних та вірусних захворювань.
Відомі способи отримання імуноглобулінів, описані в роботах Cohn E. J. et all (Journal of the American Chemical Society, 1946, v.68, p.459-475) та Oncley M. et all (Journal of the American Chemical Society, 1949, v. 71, p. 541-550). Ці роботи, що стали основою створення технологій виробництва імуноглобулінових препаратів, полягають у фракціонуванні плазми спиртовим методом при низьких температурах; виділення фракції, що містить імуноглобуліни; розчиненні та стерилізуючої фільтрації. Недоліком методівє те, що отримані препарати містять імуноглобуліни трьох класів - G, А та M, тоді як необхідною є наявність лише імуноглобулінів класу G. Присутність імуноглобулінів класів А та М може викликати побічні реакції у пацієнтів, особливо при внутрішньовенному введенні препаратів. Крім того, наявність цих домішок негативно позначається на стабільності препаратів, що викликає опалесценцію розчинів та утворення осаду в процесі зберігання.
Одним із методів видалення домішок імуноглобулінів А та М є використання іонообмінної хроматографії на діетил-аміноетил (ДЕ-АЕ)-іонообмінних сорбентах. Використання цього методу було вперше запропоновано Baumstark J. S. et all (Arch. Biochem. Biophys., 1964, v.108, p.514-522). Однак цей метод призначений для лабораторного, а не для промислового використання.
Описано методи виділення препаратів крові, включаючи імуноглобуліни, з використанням іонообмінної хроматографії (Curling JM "Separation of Plasma Proteins", 1983, Pharmacia Fine Chemicals, AB, Uppsala). Дані методи потребують кардинальних змін у технології одержання препаратів, включаючи використання спеціального обладнання.
Найбільш близьким до заявляється за технічною сутністю і досягнутим результатом є спосіб отримання імуноглобулінового препарату, описаний у збірнику "Препарати крові. Інструктивно-методичні матеріали з контролю та виробництва", за редакцією Буренкова С.П., вид. Москва, 1976, стор.203-218.
Метод полягає у фракціонуванні плазми спиртовим методом за низької температури; виділення осаду, що містить імуноглобуліни (фракція II + III); розведенні фракції II+III у рівному обсязі 2% розчину хлориду натрію та 1,5 об'ємі дистильованої води, доведенні рН розчину до 5,0-5,1;вистоювання суміші при температурі 0-1 o С; виділення баластового осаду протромбіну центрифугуванням; додаванні в центрифугат-1 етилового спирту до кінцевої концентрації 13%, при зниженні температури розчину (-3)-(-5) o; виділення баластного осаду Б центрифугуванням, фільтрації отриманого центрифугату-2, доведення рН розчину до 6,9-7,0, додаванням етилового спирту до кінцевої концентрації 25% при температурі (-8)-(-10) o; виділення осаду цільового продукту центрифугуванням; розведенні осаду імуноглобулінів у 0,9% розчині хлориду натрію, додаванні глікоколу до кінцевої концентрації 2%, що стерилізує фільтрацію. Недоліком способу є наявність домішок імуноглобулінів А та М у цільовому продукті.
Завдання, яке вирішується пропонованим винаходом, - вдосконалення технології отримання імуноглобуліну.
Технічний результат від використання винаходу полягає у підвищенні якості препарату за рахунок видалення домішок імуноглобулінів А та М.
Зазначений результат досягається тим, що в способі отримання імуноглобулінового препарату шляхом фракціонування плазми крові етиловим спиртом при низькій температурі, виділення осаду, що містить імуноглобуліни, розведення в розчині хлориду натрію, виділення осаду протромбіну центрифугуванням, додавання в центрифугат-1 етилового спирту центрифугуванням, виділення осаду цільового продукту спиртовим осадженням, розчинення осаду, додавання глікокола, стерилізуючої фільтрації, виділення баластного осаду Б здійснюють при рН центрифугату-1 5,30,05 додаванням етилового спирту до концентрації 16-18% при одночасному зниженні температури до - 5)-(-6) o З, після виділення баластного осаду Б встановлюють рН центрифугату 5,9-6,0, додають ДЕАЕ-сефадекс з розрахунку 6-10 мл на 1 л розчину, розчин інкубують протягом 1-5 год, видаляють ДЕАЕ-сефадекс фільтрацією.
Спосіб здійснюють наступним чином.
Визначення імуноглобулінів методом радіальної імунодифузії по Манчіні дозволило встановити, що обробка розчинів ДЕАЕ-сефадекс дозволяє зменшити кількість імуноглобуліну А в 10,2 рази, а імуноглобуліну М в 8,3 рази. Зміна параметрів фракціонування (рН, температури, концентрації етилового спирту) дозволяє зменшити кількість імуноглобуліну А в 56 рази, а імуноглобуліну М в 36 рази в порівнянні з прототипом. Перевагою запропонованого способу також є те, що він не вимагає значних змін технології отримання імуноглобулінів і використання спеціального обладнання.
Спосіб отримання препарату імуноглобуліну G шляхом фракціонування плазми крові етиловим спиртом при низькій температурі, виділення осаду, що містить імуноглобуліни, розведення в розчині хлориду натрію, виділення осаду протромбіну центрифугуванням, додавання в супернатант етилового спирту, виділення баластного осаду Б , розчинення осаду, додавання глікокола, що стерилізує фільтрації, який відрізняється тим, що виділення баластного осаду Б здійснюють при рН супернатанту 5,30,05 додаванням етилового спирту до концентрації 16-18% при одночасному зниженні температури до (-5) - (-6) o C, після виділення баластного осаду Б встановлюють рН супернатанту 5,9-6,0, додають ДЕАЕ-сефадекс з розрахунку 6-10 мл на літр розчину, розчин інкубують протягом 1-5 год, видаляють ДЕАЕ-сефадекс фільтрацією.
PD4A - Зміна найменування власника патенту України на винахід
(73) Нове найменуванняпатентовласника:Федеральне державне унітарне підприємство “Науково-виробниче об'єднання з медичних імунобіологічних препаратів “Мікроген”