ТИТРУВАННЯ ВІРУСУ У зразках алантоїсної рідини перед їх поєднанням та інактивацією
0, 5 мл, а решта 9 пробірок — по 0,25 мл фізіологічного розчину. У першу пробірку додають 0,05 мл алантоїсної рідини (тобто початкове розведення 1:11 або 1,04 в логарифмічних одиницях); потім, переносячи по 0,25 мл з лунки в лунку, роблять серію дворазових розведень в інтервалі від
1: 11 до 1: 5632 (від 1,04 до 3,75 логарифмічних одиниць). Після цього в кожну лунку вносять по 0,025 мл 5% суспензії курячих еритроцитів у фізіологічному розчині. Панелі струшують та поміщають у холодильник при 4°С. Через 20 хв їх струшують повторно. Реакцію враховують після інкубації 40 хв при 4°С.
За відсутності аглютинації (-) осілі еритроцити утворюють на дні лунки щільний гудзик, тоді як при повній аглютинації (++) вони тонким рожевим шаром покривають все дно. За кінцеву точку титрування умовно приймають такий ступінь аглютинації ( + ), коли діаметр осаду еритроцитів становить одну третину діаметра лунки. Інтерполуючи до цієї кінцевої точки реакцію можна врахувати з точністю +0,033 логарифмічної одиниці (±8%); якщо ж за кінцеву точку титрування прийняти останню пробірку з повною аглютинацією, то помилка методу зросте до ±0,27 логарифмічної одиниці (±86%).
Якщо титрування проводять на панелях мікротитратора (обсязі 0,025 мл; перше розведення 1:2), концентрацію суспензії еритроцитів зменшують до 1'% і суміш інкубують двічі по 20 хв при 4°С.
Одна гемаглютинуюча одиниця (ГАЕ) — це така кількість вірусу, яка спричиняє аглютинацію (+) в 1 мл 1%-ної суспензії курячих еритроцитів. Ця одиниця відповідає приблизно 4-107 (7,6 логарифмічних одиниць) вірусним часткам (Рагеказ де 51. ОгоШ, Сайлз, 1952).
Так, наприклад, якщо при титруванні з початковогорозведення 1:11 реакція ( + ) реєструється в 6-й пробірці, то в нашій системі буде містити 11 * 32 (25 = 32) аглютинуючих доз. Так як реакція відбувається в обсязі 0,25 мл, ми повинні цю величину помножити на 4. Але оскільки кінцева концентрація еритроцитів в системі дорівнює 0,5%, а не 1%, отриману величину потрібно розділити на 2. В результаті отримуємо титр 704 ДАЄ/мл, або 2,847 логарифмічних одиниць. Те саме виходить більш простим способом при складанні логарифму початкового розведення з логарифмом кінцевої точки титрування
1, 04 +1,8 = 2,84. (Відмінність у третьому знаку після коми виникає в результаті округлення логарифмів як початкового розведення, 1,0414 до 1,04, так і множника 0,30103 до 0,3 = 1о2). Підрахунок з використанням логарифмів придатний для дробових титрів. Так, при початковому розведенні 1:500 з повною аглютинацією в другій пробірці (++) і за її відсутності в третій (-) кінцева точка титрування припадає на 2,5 пробірки; звідси логарифм титру дорівнюватиме 2,7 + (0,3-2,5) = 3,45, а сам титр - 2818 ГАЕ / мл.
У середньому вихід вірусу Сендай в алантоїсній рідині дорівнює близько 1800 ГАЕ/мл, або 3,25 + 0,20 логарифмічних одиниць.