ВІРУСНИЙ ГЕПАТИТ З НОВІ ПІДХОДИ ДО ВИВЧЕННЯ ПАТОГЕНЕЗУ І РОЗРОБКА ЗАСОБІВ ДІАГНОСТИКИ І

На правах рукопису

МАСАЛОВА ОЛЬГА ВОЛОДИМИРІВНА

ВІРУСНИЙ ГЕПАТИТ З: НОВІ ПІДХОДИ ДО ВИВЧЕННЯ ПАТОГЕНЕЗУ І РОЗРОБКА ЗАСОБІВ ДІАГНОСТИКИ ТА ПРОФІЛАКТИКИ

на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Робота виконана у ФДМ «НДІ вірусології ім. Д.І. Івановського» МОЗсоцрозвитку України

Науковий консультант:

Доктор біологічних наук, професорКущ Алла Олександрівна

Офіційні опоненти:

д. б. н., професор, академік РАМНЗверєв Віталій Васильович;

д. м. н., професорМихайлов Михайло Іванович;

д. б. н., професорНаровлянський Олександр Наумович

Провідна організація: НДІ переливання крові ім. А.А. Богданова ФДБУ «Гематологічний науковий центр» Мінздоровсоцрозвитку України

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ФДМ «НДІ вірусології ім. Д.І. Івановського» МОЗсоцрозвитку України

Автореферат розісланий ……. 2011 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

Доктор медичних наукБурцева Олена Іванівна

Актуальність проблеми

Незважаючи на успіхи у вивченні молекулярно-біологічних властивостей вірусу, досі не існує єдиної концепції патогенезу ВГС-інфекції та чіткого розуміння механізму шкідливої ​​дії ВГС на клітини печінки. Як і раніше, не зовсім ясно, які фактори вірусу та господаря визначають результати гострого гепатиту С (ОДС) – реконвалесценцію абоформування хронічної інфекції, а також обумовлюють прогресуючий у цироз протягом ХГС [Sumida et al., 2010, Wadhawan et al., 2010]. Можливості вивчення структури ВГС та патогенезу захворювання обмежені складнощами культивування вірусу in vitro та експериментального зараження тварин. Більшість дослідників вважає, що ВГС не має прямої цитопатогенної дії, і головним фактором хронізації та прогресування захворювання є порушення Т-клітинної відповіді, а саме дисбаланс у співвідношенні Th1 і Th2 лімфоцитів і секретованих цитокінів [Albeldawi et al., 2010, Sha0 ].

Білки вірусу вивчені недостатньо у зв'язку з їх малою доступністю, оскільки ВГС циркулює та накопичується в організмі хворих у низьких концентраціях. Відомості про вплив білків ВГС на клітини та організм суперечливі: вірусні білки можуть супресувати або посилювати імунну відповідь, інгібувати або індукувати апоптоз [Irshad, Dhar, 2006, Pindel, Sadler, 2010, Siavoshian et al., 2005 . Досі не з'ясовано функціональну роль білків ВГС у формуванні хронічного гепатиту, а також не виявлено маркери інфекції, асоційованих з активністю та стадією ХГС. З'ясування структури та властивостей вірусних білків необхідне як для вирішення теоретичних проблем (локалізація антигенних та імуногенних детермінантів, визначення протективних епітопів), так і для вирішення завдань практичної медицини – створення профілактичних засобів, терапевтичних препаратів та діагностичних тест-систем.

Актуальною проблемою охорони здоров'я є вдосконалення діагностики гепатиту С. Для обмеження поширення ВГС-інфекції особливе значення має надійне виявлення ВГС у крові та продуктах крові. Індикація анти-ВГС антитіл в основному вирішує завданняетіологічного діагнозу, але з характеризує перебіг інфекції і вирішує завдання прогнозу результату захворювання. З цих причин важливим є розвиток методів прямого визначення виукраінспецифічних маркерів – РНК та білків, як у сироватці крові, так і безпосередньо у клітинах організму. Виявлення зазначених маркерів ВГС може вирішити проблему серонегативного «вікна», а також дати відповідь на питання про реплікацію ВГС та вірусне навантаження.

Вищевикладене свідчить про актуальність робіт, спрямованих на комплексний аналіз ролі вірусних факторів (РНК та білків ВГС) та імунної відповіді господаря (спектру антитіл до ВГС, імунокомпетентних клітин, цитокінів та інших імунорегуляторних молекул) у патогенезі гепатиту С. Ці знання необхідні для розробки діагностики, профілактики та створення специфічних препаратів для лікування гепатиту С, що дозволить контролювати це поширене захворювання.

Перераховані невирішені проблеми у вивченні гепатиту С визначили актуальність справжньої роботи, мету та завдання, які в ній були поставлені.

Мета та завдання дослідження

Мета роботи - розробити критерії оцінки активності гепатиту шляхом комплексного визначення РНК та білків ВГС у печінці та периферичній крові, маркерів функціональної активності імунної системи у хворих на гострий та хронічний гепатит С для прогнозування результатів захворювання та на підставі отриманих даних розробити вакцинну композицію, що забезпечує ефективну імунну відповідь проти ВГС.

Для досягнення мети було поставлено низку як фундаментальних, так і прикладних завдань:

Наукова новизна

З використанням отриманих моноклональних антитіл (МКА) до білків ВГС встановлено структурну організацію 10 антигеннихдетермінант, які не описані раніше. Вперше встановлено, що антигенні детермінанти білків ВГС виявляються в інфікованих клітинах печінки та мононуклеарних клітинах периферичної крові (МКПК) хворих на гепатит С з різною частотою. Найчастіше виявляються п'ять епітопів на білках NS4А, NS4B та NS5А, що може бути пов'язане з просторовою доступністю цих детермінантів.

За допомогою імунохімічних методів, розроблених на основі МКА, отримано нові дані щодо патогенетичної ролі білків ВГС. Вперше встановлено, що у хворих на ХГС накопичення core-білка в печінці та в МКПК прямо корелює з виявленням реплікативної форми РНК ВДС. Таким чином, core-білок може бути маркером активної реплікації вірусу. Частота виявлення реплікативної форми РНК ВГС, а також експресія білка NS4A у печінці та у МКПК хворих на ХГС скорочується при тяжких некрозо-запальних процесах у печінці, що може свідчити про зниження реплікативної активності ВГС при прогресуванні захворювання. Вперше показано, що гістологічна активність ХГС та підвищення рівня ферментів печінки прямо пов'язана з наявністю як геномної РНК ВГС, так і білків ВГС у тканині печінки, РНК та core-білка ВГС у сироватках крові та білків ВГС у МКПК. При ХГС вперше встановлено пряму залежність між експресією білка NS5А у печінці, виробленням антитіл до цього білка, збільшенням гістологічної активності та розвитком фіброзу, що дозволяє розглядати NS5А як один з маркерів ступеня пошкодження тканини печінки.

Аналіз білків ВГС у печінці хворих на гепатит С вперше дозволив отримати прямі докази вищої транскрипційної активності ВГС при ВГС порівняно з ХГС. При ВГС виявлена ​​пряма залежність між накопиченням білків core, NS3 та NS5A у гепатоцитах та некрозо-запальнимизмінами тканини печінки. Інтенсивна експресія білків NS4A та NS3 у печінці в період близько 1 місяця після маніфестації ВГС є предиктором спонтанної реконвалесценції.

Вперше встановлено, що накопичення білків ВГС у МКПК асоціюється з імунними розладами – скороченням частки мононуклеарних клітин та лімфоцитів у популяції лейкоцитів. При ОГС зменшення кількості СD16+-лімфоцитів пов'язане з активнішою експресією білків NS3 і NS5A ВГС в печінці (r= –0,7, p

Вміст лімфоцитів мишей, що експресують маркери Т-клітин (CD4+ та CD8+) та B-клітин (CD19+), щодо всіх CD45+-позитивних клітин (лейкоцити), оцінювали за допомогою ФІТЦ- та фікоеритрину - мічених антитіл методом триколірної проточної цитометрії (BD Bioscie США). Аналіз проводили на проточному цитофлюориметр FACS CALIBUR (Becton Dickinson, США) з використанням програмного забезпечення Cell Quest спільно з к.б.н. Пічугін А.В. та д.м.н., проф. Атауллахановим Р.І. (ФДБУ «ГНЦ Україна «Інститут імунології» ФМБА Укаїни).

ELISpot. Визначення кількості клітин, що секретують IFN-, проводили за допомогою тест-системи «ELISpot mouse IFN-» (R&D Systems, США) відповідно до інструкції фірми.

Визначення вмісту цитокінів IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-, TNF- у сироватках пацієнтів та в культуральних супернатантах проводили методом ІФА за допомогою тест-систем фірм Вектор-Бест (Новосибірськ) та Протеїновий контур (С.-Петербург). Вимірювання концентрації цитокінів у супернатантах, отриманих при культивуванні стимульованих спленоцитів мишей, проводили методом ІФА з використанням тест-систем для визначення IFN-, IL-2 – Mabtech (Швеція) та TNF- – BioLegend (США).

Рівень розчинних форм диференціювальних антигенів (sFas, sCD38, sHLA-DR та sHLA-I) визначали в сендвіч-ІФА з використанням МКА серії ІКО та поліклональних антитіл проти мембранних антигенів людини. Дані тест-системи розроблені та люб'язно надані д.б.н., проф. В.В. Новіковим (Нижегородський Державний Університет ім. М.І. Лобачевського).

Статистичну обробку результатів проводили з використанням програм «Біостатистика» (версія 4.03) та «Statistica 6». Використовувалися такі параметричні та непараметричні критерії: t-критерій Стьюдента, U-критерій Манна-Уітні, коефіцієнти лінійної регресії Пірсона та рангової кореляції Спірмена, критерій Пірсона (квадрат) і точний тест Фішера. Порівняння двох залежних (пов'язаних) вибірок проводили за допомогою критерію Вілкоксона або методу знаків. Порівняння кількох незалежних вибірок виконували за допомогою рангового двофакторного аналізу Фрідмана (Friedman ANOVA). Рівень статистичної значимості визначали при p 0,05