Вивчення генетичного розмаїття анаплазм та ерліхій

Рар В.А.(1), Ліванова Н.М.(2), Панов В.В.(2), Астанін В.Б.(3), Ліванов С.Г.(2), Морозова О . В. (1)

Наслідки анаплазму і егрлікії genetic variability в parasitic systems в South-Western Siberia і Ural Rar V.A., Livanova N.N., Panov V.V., Astanin V.B., Livanov S.G., Morozova O.V. 1 Інститут хімічної біології та фундаментальної медицини СО РАН, м. Новосибірськ 2 Інститут систематики та екології тварин СО РАН, м. Новосибірськ 3 Територіальне управління Росспоживнагляду по Новосибірській області

ДНК Ehrlichia muris та Anaplasma phagocytophilum була виявлена методом nested ПЛР у кліщах Ixodes persulcatus, зібраних у Новосибірській, Свердловській та Челябінській областях, та у зразках крові дрібних ссавців, відловлених у Новосибірській та Свердловській областях. На території Новосибірської області у зразках крові та кліщах було виявлено два генетичні варіанти A. phagocytophilum. Ключові слова: Ehrlichia muris, Anaplasma phagocytophilum, ПЛР, Ixodes persulcatus, дрібні ссавці, генетичні варіанти. Ehrlichia muris і Anaplasma phagocytophilum DNA були виявлені за допомогою незмінного PCR серед Ixodes persulcatus, зробленого в Новосібірську, Свердловську і Челябінську регіонах і в блозі текстів з малих матусь від Новосібірського і Свердловського регіонів. Два генетичні варіанти з A. phagocytophilum були поміщені в аркуші тексту та тек від Novosibirsk region. Key words: Ehrlichia muris, Anaplasma phagocytophilum, PCR, Ixodes persulcatus, невеликі mammals, genetic variants.

Ерліхіози та анаплазіози є трансмісивними природновогнищевими інфекціями. Представники пологів Ehrlichia і Anaplasma, що належать до сімейства Anaplasmataceae, є маленькими грамнегативними коками, локалізованими найчастіше всередині.фагосом лейкоцитів. Внутрішньофагосомальні ерліхії діляться, утворюючи кластери клітин, або так звані морули, що виявляються мікроскопічно після фарбування за Гімзою. [23].

Ерліхіозні та анаплазмозні інфекції у домашніх тварин були описані ще в середині ХХ ст., проте широкий інтерес до вивчення ерліхій та анаплазм виник після виявлення у сімействі Anaplasmataceae патогенних для людини видів у 1987-1994 рр.

В даний час відомо три інфекційні агенти, що викликають ерліхіози та анаплазмози у людей. Ehrlichia chaffeensis вражає мононуклеарні лейкоцити, викликаючи моноцитарний ерліхіоз людини [16], а Ehrlichia ewingii та Anaplasma phagocytophilum - гранулоцитарні лейкоцити, викликаючи гранулоцитарний ерліхіоз і 2 анаплазмоз [1]. A. phagocytophilum - нова назва виду, присвоєна після проведеного філогенетичного аналізу представників сімейства Anaplasmataceae, що об'єднав у собі мікроорганізми, раніше відомі як Ehrlichia phagocytophila, Ehrlichiaeque та HGE-агент [17].

Клінічні прояви захворювань неспецифічні і є гриппоподібними. У хворих спостерігаються гостра лихоманка, сильний головний біль, біль у м'язах, нудота. При лабораторному дослідженні виявляється зменшення кількості лейкоцитів та тромбоцитів, а також підвищення активності амінотрансферази [9]. У США було зареєстровано 338 підтверджених випадків моноцитарного ерліхіозу людини (1997—2001 рр.) та 654 випадки гранулоцитарного анаплазмозу людини (1994—2001 рр.), при цьому смертність становила близько 1%. У Європі виявлено близько 20 випадків гранулоцитарного анаплазмозу у людей [23].

Переносниками A. phagocytophilum США є кліщі Ixodes scapularis і Ixodes pacificus [9, 18, 28], а Європі — лісовий кліщ Ixodes ricinus [20, 22]. На півночіСША від 7,6 до 53,0% дорослих кліщів I. scapularis та від 1,5 до 20,6% німф інфіковані A. phagocytophilum [20, 28]. У Швеції, Швейцарії, Великобританії, Словенії, Болгарії та на північному заході України рівень зараженості I. ricinus гранулоцитарними анаплазмами варіює від 1 до 5%, тоді як в Італії цей показник досягає 24,4% [8, 20, 22]. На цей час у кліщів показана трансфазова передача A. phagocytophilum [18, 28]. Трансоваріальна передача в кліщах не встановлена [22], тому наявність резервуара інфекції відіграє важливу роль у розповсюдженні даного патогену. Основними резервуарними господарями анаплазм у США є білоногі миші (Peromyscus leucopus) та білохвости олені (Odocoiles virginianus) [27, 28], а в Європі - лісові миші (Apodemus sylvaticum), руді полівки (Clethriousy) ), Олені (Cervus elaphus), вівці [11, 20-22]. Крім I. ricinus, у підтримці паразитарної системи A. phagocytophilum у лісових районах Англії беруть участь норні кліщі Ixodes trianguliceps, що прогодовуються на дрібних ссавців [11].

Таїжний кліщ I. persulcatus Shculze широко поширений у тайгових, лісових та лісостепових зонах Укаїни від Прибалтики до Тихого океану [1], а також у Китаї [13] та Кореї [19]. В даний час у тайгових кліщах виявлено два види ерліхій та анаплазм: Ehrlichia muris та A. phagocytophilum. Моноцитарні ерліхії E. muris, спочатку ізольовані з мишоподібних гризунів у Японії [29], філогенетично близькі до збудника моноцитарного ерліхіозу людини E. chaffeensis. E. muris були виявлені в тайгових кліщах на північному заході Укаїни [8], а також у Пермській [26], Тюменській, Омській, Новосибірській областях та в Алтайському краї [6]. Рівень інфікування кліщів тайгових ерліхіями варіює від 3 до 13%.Патогенність E. muris для людини не встановлена, хоча в районі поширення цього виду в Пермській області спостерігалося чотири серологічно підтверджені випадки моноцитарного ерліхіозу людини після укусів кліщами [26]. A. phagocytophilum була виявлена в тайгових кліщах на північному заході Укаїни [3], в Алтайському та Приморському краях [6], у Китаї [13] та Кореї [19]. Рівень інфікування I. persulcatus анаплазми не перевищував 4%.

У цій роботі вивчалося видове розмаїття ерліхій і анаплазм в паразитарних системах, розташованих у місцях, близьких до оптимуму проживання тайгового кліща на півдні Західного Сибіру (в Новосибірській і Томській областях) і на Південному Уралі (Челябінська область), а також на північному кордоні ареалу кліща на Північному Уралі (Свердловська область, заповідник «Денежкін камінь»). ДНК ерліхій та анаплазм виявляли методом nested ПЛР у зразках від голодних імаго кліщів з використанням родоспецифічних праймерів з гена 16S рРНК. Видову приналежність та генетичні варіанти виявлених анаплазм та ерліхій визначали як при проведенні ПЛР з використанням праймерів, специфічних для A. phagocytophilum та E. muris, так і за допомогою визначення нуклеотидних послідовностей продуктів ПЛР [25]. Як і в попередніх роботах, було виявлено два види ерліхій та анаплазм. ДНК E. muris була виявлена у 8,6% кліщів із Новосибірської та Томської областей, у 6,3% тайгових кліщів із Челябінської області та у 2,2% кліщів із Свердловської області. A. phagocytophilum була виявлена у 2,4% кліщів із Новосибірської та Томської областей [25], у 1,3% кліщів із Челябінської та 0,7% кліщів із Свердловської області. Слід зазначити, що частка кліщів, в яких була детектована ДНК ерліхій та анаплазм, на Північному Уралі істотно менша, ніж на Південному Уралі та вЗахідного Сибіру. У жодному з 87 досліджених лугових кліщів Dermacentor reticulatus, зібраних у Новосибірській та Омській областях, та 18 Dermacentor marginatus, зібраних у Челябінській області, ДНК ерліхій та анаплазм не була виявлена [25].

Роль резервуарних господарів у підтримці природних осередків A. phagocytophilum в ареалі поширення кліща вивчена дуже мало. На Західному Уралі (Пермська область) у зразках крові приблизно у 12% рудих польок було виявлено ДНК A. phagocytophilum [5]. У проведеному дослідженні була детектована ДНК ерліхій та анаплазм методом nested ПЛР у крові дрібних ссавців, відловлених на околицях м. Новосибірська та в заповіднику «Денежкін камінь» на Північному Уралі. У зразках крові звірків, відловлених поблизу м. Новосибірська, ДНК E. muris була виявлена у 1,1% випадків, A. phagocytophilum – у 4,2%, а ДНК двох видів – у 2,1% (табл. 1). На досліджуваній території Північного Уралу частка дрібних ссавців, у крові яких детектована ДНК ерліхій та анаплазм, була суттєво вищою. ДНК E. muris була виявлена у 5,8% зразків, A. phagocytophilum – у 13,2%, а ДНК двох видів – у 1,1% зразків крові. На території Новосибірської області ерліхії та анаплазми були виявлені лише у зразках від лісових польок (Clethrionomys rutilus, Clethrionomys rufocanus), а на Північному Уралі – як у зразках від лісових польок (Cl. rutilus, Cl. glareolus, Cl. rufocan) від бурозубок (Sorex araneus L.) [2]. ДНК E. muris також була виявлена в одному з трьох досліджених зразків від ріллі полівки Microtus agrestis. Найімовірніше, резервуарними господарями можуть бути дрібні ссавці різних видів.

Відомо, що A. phagocytophilum циркулює в крові дрібних гризунів протягом досить короткого часу та виявляєтьсялише у період активності іксодових кліщів [11]. Отже, збереження патогену в паразитарній системі протягом зими підтримується кліщами, а не дрібними ссавцями. У той же час на території заповідника «Денежкін камінь» рівень інфікування анаплазмами дрібних ссавців значно вищий, ніж тайгових кліщів (табл. 1). Можливо, на цій території A. phagocytophilum циркулює за участю інших видів переносників.

Виявлення інфекційного агента гранулоцитарного анаплазмозу людини як у кліщах, так і в резервуарних господарях у різних регіонах України свідчить про існування потенційної небезпеки зараження людей цим патогеном. В даний час є поодинокі повідомлення про підтверджені серологічно випадки захворювання на гранулоцитарний анаплазмоз людини на Алтаї, в Новосибірській області [6], а також на Далекому Сході [4]. У ході цього дослідження було проаналізовано 263 зразки крові хворих, госпіталізованих до інфекційних лікарень м. Новосибірська з ознаками інфекційних захворювань після укусів кліщами. У жодному з досліджених зразків не вдалося виявити ДНК ерліхій або анаплазм [7], що може бути пов'язано як з низьким рівнем інфікованості тайгових кліщів, так і з коротким часом бактеріємії A. phagocytophilum.

Вид A. phagocytophilum поєднує в собі мікроорганізми, відповідальні за розвиток анаплазмозу не тільки у людей, а й у овець, коней, великої рогатої худоби, собак. Вивчення внутрішньовидової різноманітності проводиться порівнянням нуклеотидних послідовностей як варіабельних генів [10, 14], так і консервативних: groESL оперону [10, 24] та гена 16S рРНК [10, 13, 24]. В даний час немає однозначних даних про кореляцію між певними генетичними варіантами анаплазм та їхбіологічними властивостями. Ген 16S рРНК вважається золотим стандартом класифікації бактерій. Аналіз наявних у базі даних GenBank нуклеотидних послідовностей рибосомального гена A. phagocytophilum дозволяє виділити принаймні сім генетичних варіантів анаплазм, що розрізняються по розташованому поблизу 5' кінця гена варіабельному ділянці [13] (табл. 2).

Виявлення ерліхій та анаплазм в іксодових кліщах та у зразках крові дрібних ссавців.