Визначення у продуктах тваринництва гормонів Мета заняття Вивчити та освоїти серійний аналіз
Об'єкти дослідження. М'ясо та м'ясні продукти з яловичини, свинини та птиці.
Матеріали, реактиви та обладнання. Набір для імуноферментної очистки екстрактів, концентрований буферний розчин для промивання колонки; допоміжний набір для визначення стильбенів імуноферментним методом (кат. NSJ 2152) на 96 визначень, що включає: мікроплашку на 12-8 мм розбірних комірок із сенсибілізованими до стильбенів антитілами; буферний розчин для промивання плашки та розведення проб; білковий кон'югат; субстрат для фарбування проби; набір стандартних розчинів концентрацією стильбену від 0 до 10 нг/см3 та спектрофотометр; метилтретбутиловий або сірчаний ефір; хлороформ; розчин гідроксиду натрію молярною концентрацією 1 моль/дм3; розчин фосфорної кислоти молярною концентрацією 6 моль/дм3; розчин соляної кислоти молярною концентрацією 1 моль/дм3; розчин етанолу (70 об.%); бідистильована вода.
Приготування реактивів. Буферний розчин для промивання колонки. До однієї частини концентрованого розчину миючого буфера додають 19 частин бидистильованої води.
Буферний розчин для зберігання стовпчика. До однієї частини концентрованого розчину буфера для зберігання додають 4 обсяги бидистильованої води.
Білковий кон'югат. Концентрований кон'югат розбавляють у 15000 разів (див. інструкцію до приладу).
Субстрати А та Б для фарбування проби (див. інструкцію до приладу). Перед застосуванням субстрати змішують у співвідношенні 1:1.
Методичні вказівки. Так звані «гормональні технології» привертають увагу товаровиробників м'яса через позитивний вплив деяких гормонів на швидкий приріст маси худоби (на 5-25%). Незважаючи на заборону застосування гормонів уРеспубліці Казахстан, Укаїни, у ряді європейських країн та на Американському континенті гормони використовуються досить широко. Зростання імпорту м'яса в нашій країні робить проблему гормонального контролю дуже актуальною.
Для аналітичного визначення залишків гормональних препаратів використовують дві основні групи методів: хроматографічні (тонкошарова хроматографія – ТСХ; високоефективна рідинна хроматографія – ВЕРХ; рідинна хроматографія з мас-спектрофотометричним детектуванням – ЖХМС; газові хроматографія імуноферментний метод – ELISA та радіоімунний метод – RIA).
Серед вимог, що пред'являються до методів експрес-моніторингу продовольства, чільне місце займають чутливість і селективність методу, а також час та вартість аналізу. Деякі характеристики методів представлені у таблиці 1.
Таблиця 1 - Максимальний рівень вмісту гормонів у м'ясних
продуктах, що визначається різними методами
Як видно з даних таблиці 1, метод ELISA, який широко використовується в європейських країнах для контролю безпеки м'яса та м'ясопродуктів, має явні переваги.
Аналіз структурних особливостей складних органічних сполук показує, що розвиток метаболічних процесів у живих організмах, а також розвиток подальших процесів призводять до зменшення концентрації, наприклад, самого діетилстильбестролу та появи споріднених хімічних метаболітів, що відрізняються від вихідної речовини наявністю різних органічних замісників, т.е.
е. через певний час в залежності від хімічної стійкості токсиканту він або зникне в продукті, або трансформується, а токсичність новоутворених речовин зструктурою, подібною до вихідної речовини, виявиться близькою до токсичності початкової речовини, що також небезпечно для людини.
Пропонований до вивчення та освоєння імуноферментний метод має так звану перехресну чутливість, тобто, будучи виключно специфічним методом стосовно будь-якої речовини, дозволяє визначити всю групу споріднених сполук, що підвищує її цінність для реальної сертифікації харчової продукції за максимально можливою кількістю шкідливих. токсикантів.
Підготовка проб. Гомогенізують 2,5 г зразка м'яса або м'ясо-продукту з 15 см3 метилтретбутилового або сірчаного ефіру, гомогенат перемішують і відокремлюють центрифугуванням при частоті обертання 33,3 с-1 протягом 10 хв або відстоюванням 12 см3 ефірного шару, який випаровують в струмі . Сухий залишок розчиняють в 1 см3 хлороформу, додають 2 см3 розчину гідроксиду натрію молярної концентрацією 1 моль/дм3 до шару і шаром водного екстракту. Водний екстракт нейтралізують, додаючи до 2 см3 екстракту 200 мкдм3 розчину фосфорної кислоти молярною концентрацією 6 моль/дм3 та розчин соляної кислоти молярною концентрацією 1 моль/дм3.
порядок проведення аналізу. Весь обсяг нейтралізованого розчину наносять на імуноферментну колонку після її кондиціювання, яку для цього промивають 15 см3 попередньо розведеного розчину миючого буфера (витрата менше 3см3/хв). Екстракт пропускають через колонку самопливом, промивають колонку 5 см3 розведеного розчину миючого буфера і 5см3 бідистильованої води (витрата менше 5 см3/хв). Елююють фракцію стильбенів, промиваючи колонку 3см3 розчину етанолу (70 об.%) Колонку остаточно промивають 10 см3 розчину етанолу (70 об.%).
За допомогою піпетки в лунки плашки вносять по 100 мкдм3 розведеного буферного і 25 мкдм3 аналізованого розчинів з імуноферментної колонки (або стандартного зразка). Потім плашку витримують у темряві при кімнатній температурі (19-25 °С) протягом 1 год. За допомогою піпетки додають по 75 мкдм3 розведеного розчину кон'югату в кожну лунку плашки, витримують протягом 30 хв, промивають плашку 10-12 разів та висушують. Потім додають по 25 мкдм3 суміші субстратів А і Б у співвідношенні 1:1, витримують плашку у темряві при кімнатній температурі протягом 20 хв і додають у кожну лунку по 50 мкдм3 розчину соляної кислоти молярною концентрацією 1 моль/дм3. При цьому спостерігають за зміною блакитного фарбування розчину у лунках плашки на жовте. Оптичну густину розчинів у лунках вимірюють при довжині хвилі на спектрофотометрі 450 нм. Зміст гормонів визначають за калібрувальним графіком.
Побудова калібрувального графіка. Для побудови графіка використовують стандартні розчини відомої концентрації гормону, які поміщають у лунки плашки та забарвлюють в аналогічних з досліджуваною пробою умовах.
Експериментальні дані оформлюють у вигляді таблиці: