Врівноваження сперми з середовищем, що містить гліцерин
Існують найсуперечливіші думки щодо тривалості терміну, протягом якого сперма має контактувати з гліцерином до заморожування.
Метод Полджа з контактом протягом 18-24 год дає хороші результати, якщо судити за такими показниками, як рухливість сперматозоїдів після заморожування та відтавання і відсоток корів, що завагітніли в результаті штучного запліднення. Згідно з О'Деллом і Херстом, відсоток бичачих сперматозоїдів, що пережили заморожування в гліцеринізованому цитратно-жовточному розріджувачі або в знятому молоці, був вищим у пробах, заморожених невдовзі після додавання гліцерину, порівняно з тими, що врівноважувалися з середовищем. Емменс та співробітники стверджували, що для врівноваження сперми з гліцериновим розріджувачем достатньо 30 хв. Використаний ними розріджувач, крім гліцерину та цитрату натрію, містив арабінозу та фосфатні буфери. Ці компоненти можуть настільки змінити умови досвіду, що негайне заморожування стає можливим і навіть бажаним. Пізніше, однак, Емменс і Мартін встановили, що не спостерігалося відмінностей у відсотку завагітнілих корів при заплідненні спермою, проби якої перед заморожуванням врівноважувалися з гліцерином протягом декількох годин, і спермою, замороженою після короткочасного врівноваження. Порівняно недавно Блекшоу та ін. повідомили, що врівноважування протягом 18 годин підвищувало виживання сперматозоїдів у пробах, що заморожувалися для продажу. Більшість дослідників отримували найкращі результати при заморожуванні сперми після врівноваження з гліцерином протягом 6-18 год.
Полдж показав, що пожвавлення оброблених гліцерином бичачих сперматозоїдів після заморожування залежить від багатьох факторів, які у свою чергу пов'язані.зі швидкістю заморожування. Існує критична температурна зона від -15 до -25 °, в межах якої пошкодження, мабуть, відбуваються внаслідок або надмірно швидкого або надмірно повільного охолодження. Сперматозоїди, що знаходилися 18 годин у середовищі, що містила яєчний жовток, цитрат натрію та гліцерин, були більш стійкими до пошкоджень у критичній температурній зоні. Сперматозоїди, що знаходилися нетривалий час у середовищі, що містила гліцерин, можуть бути стійкими до пошкоджень у цій температурній зоні лише при дуже швидкому охолодженні. Отже, наявні у літературі протиріччя щодо важливого значення врівноваження з гліцерином перед заморожуванням, можливо, пов'язані із застосуванням різних швидкостей заморожування в межах зазначеної критичної температури. Полдж зазначає, що позитивний вплив, який чинить на сперматозоїди тривале врівноваження із середовищем, ймовірно, обумовлено дією не гліцерину, а інших компонентів. Наприклад, захисна дія ліпідів та ліпопротеїдів проти температурного шоку посилиться, якщо сперматозоїди перед охолодженням будуть більш тривалий час стикатися з цими речовинами. Нині відомо, що у сперматозоїдах та обмін ліпідів відбувається дуже інтенсивно.