Загальні засади виділення білків
Для вивчення білка (чи визначення його структури або біологічних функцій) насамперед необхідно виділити білок у чистому вигляді. Оскільки білкові речовини дуже чутливі до підвищення температури та дії більшості хімічних реагентів (органічних розчинників, кислот, лугів і т.д.), звичайні методи органічної хімії, що застосовуються для виділення тієї чи іншої речовини із суміші (нагрівання, перегонка, сублімація, екстракція, кристалізація і т.д.) виявилися у разі білків неприйнятними. Білки у разі піддаються денатурації, втрачаючи свою біологічну активність. Тому розроблені ефективні методи виділення білків у м'яких умовах, при зниженій температурі (не більше +4 за Цельсієм) із застосуванням хімічних реагентів, що щадять нативну структуру. Перед виділенням білків з біологічних об'єктів (органи та тканини) досліджуваний матеріал ретельно подрібнюють, аж до руйнування клітинної структури. Цей процес називається гомогенізацією. Для цього використовуються різного роду гомогенізатори, кульові млини, ультрозвук, метод "азотної бомби" (клітини насичуються азотом під тиском, потім різко скидають тиск, а газоподібний азот, що виділяється, як би "вириває" клітини). На наступному етапі з отриманого гомогенату тканин білки екстрагують Для екстракції білків широко застосовуються різні буферні суміші з певним значенням рН, органічні розчинники (водні розчини гліцерину, слабкий розчин глюкози), різні ферменти, що розщеплюють білково-ліпідні та білково-білкові зв'язки (додецилсульфат натрію, дезоксихалат натрію і т.д.). Після досягнення повної екстракції білків (тобто переведення в розчинений стан), приступають до фракціонування білків, тобто поділу суміші білків на окремі білки.поєднується з ідентифікацією. Для цього використовуються різні методи:
1) електрофорез (різні види: на папері, гелі, високовольтний і т.д.). 2) ультроцентрифугування 3) імуно-хімічний аналіз (антиген+антитіло)
4) різні види хроматографії; 5) гельфільтрація.
Для подальшого очищення білків від низькомолекулярних домішок використовують методи діалізу, гельфільтрації, кристалізації, ультрафільтрації і т.д. Всі ці методи ґрунтуються на різній розчинності, різній осаджуваності, величині (діаліз, гельфільтрація), різниці зарядів (електрофорез, іонообмінна хроматографія). Іноді використовують різну біологічну активність (це при фракціонуванні та очищенні ферментів). Але про це легко говорити, проте здійснити важко. У загальному випадку необхідна багатостадійна обробка вихідного матеріалу, на кожній з цих стадій видаляється більша частина стороннього матеріалу, присутнього в зразку після попередньої стадії поділу до тих пір, поки білок, що шукається, не буде отриманий в чистому вигляді, без домішок. Універсальної методики виділення всім білків немає. Хорошим вважається результат, коли очищення відбувається 5-6 стадій. Наприклад, виділення галоктозв'язуючого білка з кишкової палички (бере участь у транспорті галактози через мембрану) включає наступні стадії:
1) гомогенізація 2) осадження протаміном (для видалення ДНК іРНК)
3) осадження сульфатом амонію (висалівання – знижує розчинність білка).
4) хроматографія на целюлозі
5) хроматографія на гідроксил-апатіті
6) хроматографія на сефадекс
Для визначення ступеня очищення розраховують питому активність білка або використовують метод аналітичного центрифугування. Дуже ефективні методи:
1) афінна хроматографія (1968 рік)– Анфінсен та співробітники) – заснований на специфічному зв'язуванні антиген-антитіло.
2) ізоелектрофокусування – використовує відмінність у ізоелектричній точці білків (зазвичай використовують поліакриламідний гель або агарозу) – на гель наносять шар білка, який мігрує через області з різними рН, доки не досягне ізоелектричного стану.
ВІДКРИТТЯ БІЛКІВ У РОЗЧИНАХ.
Для відкриття білків у розчинах використовують кольорові реакції або реакції осадження.
Кольорові реакції розрізняють двох типів:
1)універсальні, коли реагент реагує з пептидним зв'язком (біуретова, нінгідринова) - ці реакції характерні для всіх білків.
2) специфічні – коли реагент дає пофарбовані похідні з якимись певними амінокислотами (реакція Фоля – на сірковмісні амінокислоти, реакція Міллона – на тирозин, ксантопротеїнова – азотна кислота взаємодіє з ароматичними амінокислотами, викликаючи їх нітр).
Реакції осадження поділяються на незворотні (по суті, це незворотна денатурація) і оборотні (висалівання). Про денатурацію ми вже говорили. Для висолення застосовуються великі концентрації нейтральних солей: NaCl; (NH4)2SO4; MgSO4. При цьому відбувається дегідротація та зняття заряду, що є необхідною умовою висолювання. На процес висолення впливає ряд факторів: молекулярна маса білка, гідрофільність, заряд білка тощо.
МЕТОДИ КОЛИЧНОГО ВИЗНАЧЕННЯ БІЛКІВ.
Для кількісного визначення білка у розчині широко використовуються методи, засновані на використанні оптичних властивостей білків.
1) Рефрактометричний метод (прилад рефрактометр) – чим більша концентрація білка в розчині, тим на більший кут відхиляється проміньсвітла, пропущений через розчин білка, що фіксується приладом.
2) Нефелометричний метод (прилад – нефелометр). Заснований на властивості білкових розчинів розсіювати світло. Відповідно, що стоїть концентрація білка в розчині, то більше вписувалося ступінь розсіювання світла.
3) Спектрофотометричний метод (прилад – спектрофотометр). Заснований на властивості розчину білка поглинати світло в ультрафіолетовій частині спектора. Чим більше білка в розчині, тим більше поглинання цим розчином ультрафіолетових променів, що фіксується приладом.
4) Поляриметричний метод (прилад – поляриметр). Заснований залежно від обертання площини поляризованого світла, що пропускається через білковий розчин, від концентрації білка.
5) Крім методів, заснованих на оптичних властивостях білка, широко використовується колориметричний метод. Суть методу: проводять кольорову реакцію і через фарбований розчин білка пропускають світло з певною довгою хвилі. Частина світла поглинається забарвленим розчином білка. Ступінь поглинання залежить від концентрації білка у розчині.
СТРУКТУРА БІЛКУ.
Білки мають складну просторову структуру. Зазвичай прийнято говорити про чотири рівні структурної організації білкової молекули.
1) Первинна структура визначається:
а)природою входять у молекулу амінокислот;
б)відносною кількістю входять до молекули амінокислот;
в) строго певною амінокислотною послідовністю поліпептидного ланцюга (або ланцюгів). Якщо є простетичні групи, їх склад і кількість впливають на первинну структуру. Вперше первинну структуру одного з білків (інсуліну) визначив 1951 року Сенджер (потрібно кілька років). Він показав, що амінокислотна послідовність інсулінумістить 51 амінокислоту. У 1975 році було встановлено первинну послідовність аспартатамінотрансферази (412 залишків). На цей час відома амінокислотна послідовність приблизно 1500 білків. За минулий час, методи дослідження були значно вдосконалені і тепер визначення амінокислотної послідовності викликає менше труднощів. Використовуючи, зокрема, автоматичні секвенатори, що працюють з дуже малими кількостями зразка (10-12 ступеня моль). Розшифровано амінокислотну послідовність молекули антитіла альфа-глобулінової фракції крові – встановлена амінокислотна послідовність включає 1320 амінокислотних залишків! Необхідно відзначити, що послідовність амінокислот закодована в генах, тому при синтезі білка формування первинної структури відбувається не спонтанно, а згідно з інформацією, закодованою в генах. Для первинної структури характерна видова специфічність, тобто кожен вид тварин організмів має свою, неповторну первинну структуру у білків, що виконують ту саму функцію у різних видів. Наприклад, інсулін людини, свині, собаки, корови тощо для кожного виду має свою послідовність амінокислот, хоча й виконує аналогічну функцію. Тому введення інсуліну будь-яких тварин людині не дає біологічного ефекту.
Вищі рівні структури білків, зокрема, загальна конформація та біологічна активність білка тісно пов'язані та фактично визначається амінокислотною послідовністю. Це переконливо підтверджують синтез Меррифільдом ферменту рибунуклеази (124 амінокислотні залишки). Цей синтезований фермент прийняв таку ж конформацію, як і нативний фермент і мав таку ж біологічну (ферментативну) активність. Отримано багато подібнихфактів та з іншими синтетичними білками (пептидами).
Свідчення іншого роду накопичені на підставі вивчення серповидно-клітинної анемії – спадкової хвороби, коли здатність еритроцитів зв'язувати кисень знижується. Інтактна молекула гемоглобіну складається з двох бетта-ланцюгів і двох альфа-ланцюгів. Бетта-ланцюг нормального гемоглобіну дорослої людини в шостому положенні містить глутамінову кислоту. У серповидних клітинах (характерно зміненої форми) – бетта-ланцюг у шостому положенні містить валін. Всі інші амінокислоти у складі бета-ланцюга та альфа-ланцюга абсолютно однакові. Незважаючи на таку малу відмінність (при загальній кількості амінокислотних залишків дорівнює 574), молекула гемоглобіну S має знижену здатність зв'язувати кисень, мабуть через те, що молекули гемоглобіну S мають тенденцію злипатися, утворюючи агрегати великого розміру, що і викликає зміну форми еритроцитів і перетворення їх на серпоподібні. Деформовані еритріоцити можуть затримуватись у вузьких кров'яних судинах, що ще більше знижує доставку кисню до тканин. Вони легко руйнуються, що викликає анемію,
Але було б неправильно вважати, що кожен амінокислотний залишок у кожному білку необхідний збереження нормальної структури та функції білка. Це не так. Наприклад, було виявлено багато варіантів амінокислотних послідовностей гемоглобіну, що функціонують нормально. Ймовірно, можна вживати поняття про «необхідні» (істотні) і «допустимі заміщення» (малоістотні) залишки амінокислот у поліпептидному ланцюжку білка.
Виходячи з викладеного, можна відзначити важливе значення первинної структури білкових молекул:
1) визначає загальну конформацію та біологічну активність білка,
2) Визначає видову специфічність,
3)дозволяє визначати молекулярні патології,
4) дає можливість синтезувати білок із заданими біологічними властивостями (вперше був синтезований інсулін Сенджером у 1964 році).
Як визначити первинну структуру. Перед тим, як приступити до секвенування, зазвичай проводять деякі важливі попередні дослідження, для чого необхідно мати очищений препарат білка.Визначають:
1)Молярну масу та оцінюють чистоту препарта,
а) колончаста хроматографія (гельфільтрація – використовується агароз або декстран);
б) електрофорез у поліакриламідному гелі (застосовується для поділу, очищення, оцінки чистоти та для визначення молекулярної маси);
в) аналітичне ультроцентрифугування.
2) Визначає тип та число простетичних груп. При секвенуванні їх іноді відокремлюють від білкової частини.
3) Визначаються внутрішньо-і міжмолекулярні дисульфідні зв'язки та одночасно визначається число сульфгідрильних груп цистеїну.
4) Білки, що мають четвертинну структуру, поділяють на окремі поліпептидні ланцюги (змінюють pH, обробляють поверхнево-активними речовинами і так далі).
Природу та кількість амінокислот, що становлять білок, визначають, проводячи розщеплення білка до окремих амінокислот і потім аналізують цю суміш. Звичайним методом розщеплення є кислотний гідроліз, або замість соляної кислоти додають метансульфонову кислоту. (12-36 годин при температурі 100-110 градусів, частіше в атмосфері азоту). Більш м'який метод - з використанням протеолітичних ферментів (пептидаз), але тут можливе забруднення (крім розщеплення поліпептиду, вони можуть каталізувати власне розщеплення). Якісно та кількісно визначаються амінокислоти за допомогою хроматографії.
Визначенняпослідовності амінокислотних залишків поліпептидної ланцюга зазвичай починається з визначення кінцевих залишків. С-кінцеву амінокислоту можна визначити, обробивши поліпетид гідразином (NH2 – NH2 ), який реагує з гідроксильними угрупованнями у складі пептидного зв'язку, але не утворює сполуки з кінцевою карбоксильною групою. Внаслідок цього кінцеву (С - кінцеву) амінокислоту можна виділити та ідентифікувати, використовуючи хроматографічні методи. Інший метод – обробка поліпептиду карбоксипептидазою (виділяється із шлункового соку). Вона досить специфічно відщеплює С-кінцеві залишки поліпептиду. Необхідно контролювати лише швидкість відщеплення амінокислотних залишків
Амінопептидаза – атакує поліпептидний ланцюг з іншого кінця. І карбоксипептидаза і амінопептидаза є екзопептидазами, тобто каталізують відщеплення кінцевих амінокислотних залишків. Для ідентифікації N-кінцевої амінокислоти використовують: реактив Сенджера (2,4-динітрофторбензол), або реактив Едмана (фенілізотіоціонат) або дансилхлорид. Але саме при використанні реактиву Едмана розщеплюється перший (а не кілька) пептидний зв'язок.