1.4. Фізико-хімічні властивості білків
Фізико-хімічні властивості білків
Первинна структура білків значною мірою визначає вторинну, третинну структури та особливості четвертинної структури. У свою чергу, первинна та просторова структури білків, їх молекулярна маса, форма та розміри зумовлюють їх фізико-хімічні властивості.
Молекулярна маса білків досить велика, тому вони відносяться до високомолекулярних сполук. Молекулярна маса білків коливається від 6 000 до 1 000 000 Дальтон і вище, вона залежить від кількості амінокислотних залишків у поліпептидному ланцюгу, а для олігомерних білків, що мають четвертинну структуру – від кількості протомерів (субодиниць), що входять до них.
Молекулярна маса деяких білків становить: інсулін – 5700Д,
Пепсин-35000Д, гемоглобін - 65000Д.
Молекулярну масу білка можна визначити за швидкістю седиментації при ультрацентрифугуванні, тобто. при прискоренні 100 000-500 000 G . На підставі цього визначають коефіцієнт седиментації, який позначають S (на честь шведського вченого СВЕДБЕРГА). Він запропонував за одиницю коефіцієнта седиментації величину 10-13. Молекулярна маса більшості білків коливається не більше 1-20S.
Іншим методом визначення молекулярної маси є метод гельфільтрації (молекулярне просіювання). Використовується штучно створені гранули, що мають пори (гранули СЕФАДЕКСУ). Всередину гранули можуть проникати лише сполуки певного розміру: молекули невеликого розміру входять у гранули, а більші швидше вимиваються. Молекулярна маса розраховується орієнтовно. Буфер не затримується, а білок рухається тим повільніше, що менше молекулярна маса.
Білки здатні зв'язуватися із лігандами.
Білки специфічно дізнаються про свої ліганди, що обумовленокомплементарним
будовою певної ділянки білка та ліганду.
ВИБОРЧІСТЬ забезпечується білковою частиною гемоглобіну. Центр зв'язування Ліганду називається активним центром. Ця властивість є основою іншого методу поділу білків – афінної хроматографії.
Білки мають різну форму, але виділяють дві основні групи: глобулярні (кулясті) і фібрилярні (веретеноподібні). Глобулярні білки компактніші, у цих білках гідрофільні групи розташовані переважно зовні, а гідрофобні – усередині, утворюючи ядро.
На основі відмінностей білків у молекулярній масі, розмірів та формі їх можна розділити за допомогою ультрацентрифугування (за швидкістю седиментації), методом гель – фільтрації (молекулярного просіювання в сефадексі).
Відмінності первинної структурі білків, їх зміни, молекулярної масі, розмірах визначають різноманітні властивості білків. Можна виділити кілька груп фізико-хімічних властивостей.
Електрохімічні властивості білків.
Білки — амфотерні поліелектроліти, тобто подібно до амінокислот вони мають кислотні й основні властивості. Ці властивості білка обумовлені електрохімічною природою R-радикалів амінокислот, що входять до складу білка. Оскільки більшість іоногенних і полярних R-груп знаходиться на поверхні білкової глобули, то саме вони визначають кислотно-основні (амфотерні) властивості та заряд білкової молекули. Кислі властивості білку надають аспарагінова та глутамінова амінокислоти, дисоціація їх карбоксильних груп є джерелом негативних електричних зарядів на поверхні білкової молекули. Основні властивості білку надають лізин, аргінін, гістидин, здатні до протонування та створення на поверхні білкової молекули позитивних зарядів. В амфотернуприроду білкової молекули роблять внесок (хоч і несуттєвий) її N- і С-кінцеві амінокислоти. Слабка дисоціація SН-груп цистеїну та ОН-груп тирозину дуже несуттєво впливає на амфотерність білків. В цілому, чим більше кислих амінокислот міститься в білку, тим сильніше виражені його кислотні властивості, тим вища сумарна щільність негативного заряду, і чим більше основних амінокислот, тим яскравіше виявляються основні властивості білка і вище щільність позитивних зарядів на його молекулі. Проте слід зазначити, що значення рК радикалів амінокислот коливаються у досить широких межах.
Амфотерна природа білків зумовлює певну буферність їх розчинів. Проте за фізіологічних значеннях рН вона невелика. Виняток становлять білки, що містять велику кількість гістидину, оскільки тільки бічні імідазольні групи гістидину мають буферні властивості в інтервалі значень рН, близьких до фізіологічних. Таких білків мало; до них відноситься, наприклад, гемоглобін тварин, що містить8%гістидину, що зумовлює високу внутрішньоклітинну буферність в еритроцитах, підтримуючи рН крові на постійному рівні.
Сумарний заряд білкової молекули визначається співвідношенням у ній кислотних та основних радикалів амінокислот та величиною їх рК. Якщо в білку кислі амінокислоти переважають над основними, то в цілому молекула білка електронегативна, тобто знаходиться у формі поліаніону; і навпаки, якщо переважають основні амінокислоти у формі полікатіону.
Амфотерний характер білків особливо яскраво проявляється за зміни рН білкового розчину. У кислому середовищі в результаті високої концентрації Н + -іонів йде пригнічення кислотної дисоціації карбоксильних груп та інтенсивне протонування NH - 2, -NH-, імідазольних груп -сумарний заряд білкової молекули буде позитивним; у лужному середовищі при надлишку ОH-іонів спостерігатиметься зворотна картина: інтенсивна дисоціація карбоксильних груп та депротонування основних груп — сумарний заряд негативний. Природно, кожен білок при якомусь певному значенні рН матиме сумарний електричний заряд, рівний нулю; такий стан білка називаєтьсяізоелектричним станом,а величина рН, що обумовлює цей стан, називаєтьсяізоелектричною точкою(ІЕТ). У цій точці білок не має рухливості в електричному полі; має найменшу розчинність у воді; білкові розчини мають мінімальну стійкість і мінімальний осмотичний тиск. ІЕТ кожного білка визначається співвідношенням кислих та основних груп, величиною їх рК: чим більше це співвідношення і нижче величина рК груп, тим нижче ІЕТ білка. У кислих білків ІЕТ 7; при рН ІЕТ - у формі поліаніону, в ІЕТ - у формі амфотерного полііону (цвіттер-полііону). ІЕТ більшості білків клітин тварин, рослин, мікроорганізмів лежить у межах 5,5-6,0, а внутрішньоклітинна величина рН знаходиться в межах 7,0-7,2 (фізіологічне значення рН). Отже, клітинні білки мають загалом негативний заряд, що врівноважується неорганічними катіонами.
Оскільки кожен білок у водних або буферних розчинах має сумарний заряд певної величини, ця властивість білків знайшла широке застосування для їх поділу методом електрофорезу. Він ґрунтується на пересуванні зарядженої частинки в електричному полі. Рух частинки відбувається в рідкому середовищі, яке утримується інертним твердим носієм, наприклад смужкою паперу, гелевою плівкою з крохмалю, опарою, поліакриламідами, декстраном, ацетатом целюлози, що дозволяєістотно знизити дифузію білків, що фракціонуються, на відміну від електрофорезу у водному середовищі. Рідина служить провідним середовищем для електричного поля, коли до неї прикладена зовнішня напруга. Рухливість зарядженої молекули в електричному полі називається електрофоретичною рухливістю.
У поділі білків найбільшого поширення набув електрофорез у поліакриламідному гелі (ПААГ), який застосовується для поділу, очищення, оцінки чистоти та визначення молекулярної маси. Гель поліакриламідної матриці у вигляді однорідного тонкого шару (а не гранул) можна помістити між двома пластмасовими пластинками або заповнити цим гелем трубочки. Структура поліакриламіду пошита поперечними зв'язками, завдяки чому цей матеріал має розвинену пористість.
Колоїдні властивості білків
Водні розчини білків – це стійкі системи, за цією властивістю їх можна віднести до справжніх молекулярних розчинів. Однак висока молекулярна маса білків надає їм колоїдного характеру.
Як правило, діаметр білкових глобул перевищує 0,001 мкм. Молекули білків не здатні дифундувати через напівпроникні мембрани целофан. На цьому явищі засноване очищення білків від низькомолекулярних домішок методом діалізу, очищення та концентрування білків методом ультрафільтрації. При діалізі целофановий мішечок із розчином білка поміщають у посудину з проточною водою. Зовнішні стінки мішечка омиваються водою. Низькомолекулярні речовини дифундують через мембрану і видаляються разом із водою, а білки залишаються. При ультрафільтрації мембрана діє молекулярний фільтр.
Біологічні мембрани живих клітин також є непроникними для білків. Тому білки, що містяться в протоплазмових структурах цих клітин, створюють у них певнеосмотичний тиск, званий колоїдно-осмотичний або онкотичний тиск.
Малу швидкість дифузії мають білки і у водних розчинах, вона залежить не тільки від молекулярної маси, але і від форми білкової молекули. Глобулярні білки у водних розчинах мають вищий коефіцієнт дифузії, ніж фібрилярні.
Характерними ознаками колоїдного характеру білкових розчинів є їхня опалесценція, блиск і здатність розсіювати промені світла (ефект Тіндаля).
Якщо через кювету з розчином низькомолекулярної речовини, наприклад, NaС1, пропустити пучок світла, то в кюветі він не буде виявлений, розчин є «оптично порожнім». Інша картина буде спостерігатися в кюветі з розчином білка, при бічному освітленні в ній з'являється смуга, що світиться або конус. При проходженні світла через розчин, що містить білкові глобули, радіус яких набагато перевищує довжину хвилі світла, спостерігатиметься дифракція світла: падаючи на білкову глобулу, світло відображатиметься в різних напрямках.
Світлорозсіювальна здатність білків може бути використана при визначенні концентрації білкових розчинів методами нефелометрії та турбідиметрії, заснованих на порівнянні інтенсивності світлорозсіювання цих розчинів.
Гідратація білків – здатність білків зв'язувати воду. 100 г білка пов'язує 30-35 р води.
. Вода зв'язується іоногенними групами та пептидними групами, розташованими в основному, всередині молекули білка. Проникнення води всередину молекули білка називається набуханням. Зв'язування води іоногенними групами, що розташовані на поверхні білкової молекули, призводить до утворення гідратної оболонки. Кількість зв'язаної води для різних білків становить близько 35 г на 100 г білка. Пов'язана вода у гідратній оболонцізнаходиться у впорядкованому стані, що призводить до зменшення ентропії при гідратації.
1.3.4 Розчинність білків у воді
Багато білків добре розчиняються у воді, що визначається кількістю полярних груп. Розчинність глобулярних молекул краща, ніж фібрилярних білків. Чинники, що визначають стабільність білкових розчинів:
- Наявність зарядів у білковій молекулі. однойменні заряди сприяють розчинності білка, т.к. перешкоджають з'єднанню молекул і випадання осаду.
- Наявність ГІДРАТНОЇ оболонки, що перешкоджає поєднанню білкових молекул. Для осадження білка його необхідно позбавити цих двох факторів стійкості. Методом осадження білка є вливання-осадження білка за допомогою нейтральних солей - (NH4)2-S04.
У напівнасиченому розчині (NH4)2-SO4 осаджуються глобуліни, а насиченому - альбуміни.
Після видалення осаджуючого фактора білки переходять у розчинений стан.
Лабільність просторової структури білка.
Під впливом зовнішніх чинників може відбуватися порушення вищих рівнів організації білкової молекули (вторинної, третинної, четвертинної структур) за збереження первинної структури. При цьому білок втрачає свої нативні, фізико-хімічні та біологічні властивості. Це називається денатурацією. Денатурацію викликають хімічні фактори (підвищення температури, тиску, механічна дія, УЗ, іонізуюче випромінювання), хімічні фактори (кислоти, луги, органічні розчинники -спирт, фенол; солі важких металів). і завдав легкої руйнації молекулі. В останні роки встановлено, що в організмі є білки, що запобігають денатурації. ШАПЕРОНИ - клас білків,що захищає в умовах клітини інші білки від денатурації. Вони полегшують формування просторової конфігурації білків. До них відносяться білки теплового шоку чи білки стресу.