2 Автофлуоресцентна діагностика онкологічних захворювань гортані та глотки
Для розміщення оптоволоконного зонда в порожнині горла розроблена гортанна насадка на світловод (4), з дистальним кінцем волоконно-оптичного датчика. Насадка є порожнистою металевою трубкою діаметром 0.4-0,6 см з ручкою-тримачем, через яку проходить світловод. Кінець трубки вигнутий на відстані 4-5 см від робочого торця під кутом 100-110 градусів, що відповідає анатомічній формі гортані. Важливою є можливість стерилізації насадки та, як наслідок, її багаторазове використання у різних пацієнтів (5).
Управління режимами роботи спектроаналізатора, реєстрація та накопичення спектрів здійснювалася за допомогою програмного забезпечення, що працює під операційною системою Windows. Спектрограми кожного пацієнта зберігаються у архіві з урахуванням ПК (8).
Для отримання неспотворених спектрів перед початком експериментів було проведено калібрування приладу на спектральну чутливість і калібрування по довжинах хвиль з використанням стандартних спектральних джерел.
In vivo дослідження, які полягали у реєстрації спектрів автофлуоресценції новоутворень слизової оболонки гортані та ротоглотки, проводились на базі КБ СДМУ ім. С.Р. Миротворцева м. Саратова за протоколами, рекомендованими комітетом з етики ГОУ ВПО «Саратовський державний медичний університет».
При проведенні серії вимірювань задавалася постійна (відносно контрольного зразка) інтенсивність азотного лазера, що дорівнює 1600 відносних одиниць.
Спектри фіксувалися шляхом прямого контакту (дотику) світловода з поверхнею слизової оболонки під кутом 90%. Таким чином, здійснювався процес точкового зондування новоутворення таслизової оболонки на периферії. Для дослідження було обрано 3 зони: центральна частина новоутворення; периферія новоутворення (зона візуального кордону зі здоровою тканиною); мабуть незмінена тканина (здорова). Для кожної локалізації проводилося 3-4 виміри, отримані дані усереднювалися.
Щоб уникнути хворобливих відчуттів та блювотних рефлексів у пацієнтів, дослідження проводились під місцевою анестезією (лідокаїн 10%).
Так як спектр автофлуоресценції тканини навіть однієї локалізації сильно варіює від пацієнта до пацієнта, при вимірюваннях на кожному пацієнті реєстрували в якості реперної точки спектри автофлуресценції язичної поверхні надгортанника (при дослідженнях гортані) або малого язичка (при дослідженнях глотки).
Критерії включення до дослідження:
- вік від 18 до 70 років;
- новоутворення гортані та (або) глотки (доброякісне або злоякісне), що верифіковане або потребує гістологічного обстеження;
- хронічне захворювання гортані або глотки, що потребує подальшого гістологічного дослідження;
- згода на участь у дослідженнях;
- здорові особи (контрольна група).
- вагітні та годуючі;
- які зазнали місцевого інвазивного методу лікування або діагностики з приводу перелічених захворювань протягом останніх 3 тижнів;
- анатомо-фізіологічні особливості, що перешкоджають проведенню дослідження;
- застосовували антибіотики тетрациклінового ряду останні 2 тижні (цей критерій пов'язаний з наявністю сильної люмінесценції тетрацикліну);
- піддані діагностичним заходам із запровадженням екзогенних флуорофорів.
У додаткових запобіжних заходах до та після діагностичного вимірювання пацієнти непотребують.
При еx vivo спостереженнях досліджувалися біоптати новоутворень слизової оболонки гортані та глотки, отримані під час операції (біопсії), а також гортань та фрагменти слизової оболонки глотки, отримані в результаті ларингектомії та циркулярної резекції глотки.
Перед вимірами препарати відмивалися від видимих слідів крові фізіологічним розчином.
Вимірювання проводилися, по можливості, за таких же умов торкання зразка торцем оптоволоконного зонда, як і вимірювання in vivo. Дослідження проводилися пізніше, як за 5 годин після видалення ділянок тканини. При цьому зразки зберігалися у фізіологічному розчині.
Обробка отриманих результатів
КДК - коефіцієнт діагностичної контрастності параметр за чисельним значенням якого виноситься діагностичне рішення. КДК обчислювався за співвідношенням значення інтенсивності автофлуоресценції у підозрілій на наявність новоутворення ділянці, до значення інтенсивності автофлуоресценції незміненої слизової оболонки, тобто:
КДК=I1/I2,
де I1 – інтенсивність автофлуоресценції новоутворення, I2 – інтенсивність автофлуоресценції здорової слизової оболонки обстежуваного на тій же довжині хвилі. Для визначення довжини хвилі, при якій значення КДК є найбільш інформативним, у процесі досліджень розрахунок проводився по всьому спектру.
Важливою особливістю КДК є те, що при його розрахунку зіставляються виміряні значення фізичних параметрів у пухлинних тканинах і незмінених тканинах цього пацієнта, що дозволяє виключити вплив структурно-функціональних особливостей тканин обстежуваних осіб.
У зв'язку з тим, що спектри флуоресценції можуть залежати як від особливостей структури та складу ділянки, що досліджується, так і від умовзондування (кут нахилу зонда, сила притиску тощо), щоб одержати достовірних даних нами проводився набір статистики. При проведенні флуоресцентної діагностики отримували велику кількість виміряних спектрів (щонайменше 12 від кожного обстежуваного). За отриманими даними, розраховувалися середні значення інтенсивності флуоресценції нормальних ділянок (Iфл.н.) та флуоресценції пухлини (Iфл.о.) для кожного пацієнта. Ці значення використовувалися визначення КДК здорової і ураженої новоутворенням слизової оболонки в кожного пацієнта.
Для реєстрації та архівування даних, отриманих в результаті дослідження всіх груп пацієнтів, було складено протокол дослідження, до якого вносилися паспортні дані, попередній та заключний діагнози, дата дослідження, номери файлів з результатами спектроскопії. Отримані в результаті обстеження спектри автофлуоресценції вносилися до бази даних.
Весь досліджуваний матеріал, після проведених вимірювань, прямував до патологоанатомічного відділення КБ СДМУ ім. С.Р. Миротворцева для гістологічного дослідження.
Ефективність автофлуоресцентної спектроскопії визначали на підставі порівняння даних спектроскопії (розрахунок КДК, аналіз форми спектра та значень інтенсивності автофлуоресценції) з результатами, отриманими під час гістологічного дослідження. Статистична обробка результатів дослідження проведена за допомогою комп'ютерної програми Mathcad 2001 Professional.
У дослідженні брали участь 50 хворих віком від 18 до 70 років, контрольну групу склали 10 осіб без патології з боку гортані та горлянки (таб. 1).
Таблиця № 1. Групи дослідження.
Дослідження проводилися в умовах ex vivo та in vivo. Кількісне співвідношення видів дослідження представлене втаблиці 2.
Таблиця №2.Кількісне співвідношення видів дослідження.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
У третьому розділі проведено аналіз даних, отриманих при проведенні методу автофлуоресцентної спектроскопії, а також їх зіставлення з діагнозами, які були встановлені на підставі клінічних та гістологічних результатів обстеження.
При обстеженні 31 пацієнта із злоякісними новоутвореннями гортані та глотки (група I) отримано характерні спектрограми, представлені на рис.3.
Розмір інтенсивності автофлуоресценції кожного дослідження усереднювалася, як мінімум, за трьома вимірами.
У всіх розглянутих випадках плоскоклітинного раку реєструвалися спектри з великою різницею інтенсивностей автофлуоресценції здорової та пухлинної тканини та характерними максимумами на 370 нм та 440 нм. Характерною рисою всіх проведених нами вимірів є значно знижена інтенсивність автофлуоресценції у вогнищі малігнізації. Інтенсивність спектрів автофлуоресценції раку розташовувалися в інтервалі від 0,1 до 0,5 відносних одиниць.
Середня інтенсивність автофлуоресценції плоскоклітинного раку на довжині хвилі 440 нм дорівнювала 0,25±0,09 отн.од., за коефіцієнта варіації 36%. Середня інтенсивність візуально здорової слизової оболонки становила 2,91±0,45 отн.од., коефіцієнт варіації 15,1%.
Виходячи з отриманих даних, обчислювався коефіцієнт діагностичної контрастності (КДК) - діагностичний критерій, що дозволяє припустити наявність злоякісного новоутворення на узятій ділянці слизової оболонки. Середнє значення КДК групи обстежених зі злоякісними новоутвореннями гортані і горлянки дорівнювало 14,56±5,59. Коефіцієнт варіації – 37,8%. За спектромспостерігається незначна зміна КДК, однак найбільші відмінності норма/патологія отримані в області 400 нм.
Поряд із загальним зменшенням інтенсивності флуоресценції з розвитком злоякісного новоутворення спостерігається зміщення максимальної інтенсивності в спектрі від 408-410 нм для норми до 435-455 нм у разі новоутворення. У міру просування до центру пухлини це усунення стає більш вираженим.
Характер спектрів при зміні локалізації зондування виявляє явну кореляцію з морфологічною будовою та відповідає поняття про гістологічну будову злоякісної пухлини та здорової слизової оболонки гортані та глотки (рис.4), (рис.5).
Мал. 4 Гістологічний препарат, що відповідає спектру центральної частини неороговеючого раку гортані.
При обстеженні 19 пацієнтів із доброякісними новоутвореннями гортані та глотки (група II) характерним є графік, представлений на рис.6.