АНАЛІЗ ЦИРКУЛЮЮЧИХ МІКРОЧАСТИН ПЛАЗМИ КРОВІ МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЇ ЦИТОМЕТРІЇ
Мікрочастинки (мікровезикули) - це сферичні структури, оточені ліпідним біслоєм, які секретуються з поверхні різних клітин у міжклітинний простір містять усі компоненти клітинної мембрани характерні для їх клітини. Мікрочастинки виявлені у всіх рідинах організму, таких як кров, сеча, слина, грудне молоко (Cocucci E., 2009, Taylor D., 2008), що робить їх потенційним джерелом біомаркерів для діагностики, прогнозування захворювань та моніторування різних станів організму. Збільшення концентрації мікрочастинок у крові хворих при різних патологічних станах підтверджує думку, що мікрочастинки відіграють роль у патогенезі та розвитку захворювань, у тому числі різних видів раку, інфекційних захворювань, аутоімунних захворювань, тромбоемболічних ускладнень та інших (Manshouri T., 2003; Ghosh A.). 2010; Oehmcke S., 2012). Тим не менш, більшість з цих досліджень є спостережливими і, можлива роль мікрочастинок, як прогностичних біомаркерів у стратифікації груп ризику захворювання, лише починає вирішуватися. Інтерес, що виник останніми роками до вивчення мікрочастинок, що виділяються різними типами клітин, потребує формування нових методичних підходів. Ряд методів, що використовуються в даному напрямку, включає проточну цитометрію, ELISA, а також нові технології Fluorescent Nanoparticle Tracking Analysis (FNTA) (Dragovic R.A., 2011). Оскільки на мікрочастинках є такі ж поверхневі антигени, як і на батьківських клітинах, імунофенотипування мікрочастинок методом проточної цитометрії, на даний момент, є найбільш використовуваним методом для їх характеристики (Orozco A.F., 2010). У нашій роботі методом проточної цитометрії ми досліджували мікрочастинки плазми крові В-лімфоцитарного.походження за допомогою CD20 та CD19 антигенів, які є основними маркерами для фенотипування В-лімфоцитів.
Виділення мікрочастинок із плазми крові
При дослідженні мікрочастинок визначальне значення має спосіб їхнього виділення (Dey-Hazra E., 2010). В даний час центрифугування є одним з основних методів виділення мікрочастинок із плазми крові, але на даний момент не існує єдиного стандартного протоколу виділення. Ми модифікували наявні протоколи для наших завдань. Кров у кількості 5 мл забиралася у донорів, центрифугували 20 хвилин при 2500g. Отриману плазму центрифугували ще раз за тих самих умов. Потім 0,5 мл плазми центрифугували при 13000g протягом 40 хвилин при 4°З осадження мікрочастинок. До осаду додавали 1 мл фосфатно-сольового буфера і повторно центрифугували. Отриманий осад розводили в 0.5 мл фосфатно-сольового буфера та використовували для аналізу.
Аналіз мікрочастинок за допомогою проточної цитометрії
На даний момент основним методом, який використовується для характеристики циркулюючих мікрочастинок, є метод проточної цитофлуориметрії. Незважаючи на це, немає стандартних протоколів для їх визначення. Цей метод дозволяє визначити відносний розмір (пряме світлорозсіювання, FСS) та відносну гранулярність (бічний світлорозсіювання SSС) частинок. Оскільки нині немає консенсусу по пороговому значенню (значення, що характеризує мінімальний розмір мікрочастинок, який можна детектувати з допомогою проточного цитометра) ми визначали пороговий рівень по фоновому шуму. Фоновий шум визначався за кількістю подій при фільтрованому двічі (фільтр 0,22 мкм) фосфатно-буферному розчині (Малюнок 1А). Для визначення відносного розміру мікрочастинок були використані стандартнікалібрувальні намисто 0,3 мкм, 1,1 мкм, 2 мкм і 3 мкм, за допомогою яких виставлялися ворота для визначення діапазону досліджуваних частинок (рисунок 1Б). Виходячи з літературних даних розмір мікрочастинок визначається в діапазоні 0,2-2 мкм, крім того, межа чутливості проточного цитометра не дозволяє визначати везикули менше 0,3 мкм.
Щоб оцінити мікрочастинки плазми В-лімфоцитарного походження ми використовували CD20 і CD19 маркери, які є основними для фенотипування В-лімфоцитів. Для фарбування антитілами по 30 мкл мікрочастинок розкопували в 96-лунковий планшет, додавали по 3 мкл CD20-PE, CD19-FITC (фірма) антитіл або ізотипічний контроль, інкубували 30 хв, переносили в центрифужні пробірки, потім додавали 2 мл фосфатно-сол та центрифугували при 13000g. Отриманий осад розводили в 0,5 мл фосфатно-сольового буфера та аналізували на проточному цитометрі FACSCanto II (BD Biosciences). Для імунофенотипування лімфоцитів використовували стандартну методику лізису еритроцитів з подальшим центрифугуванням. Імунофенотипування лімфоцитів проводили за стандартним протоколом фірми-виробника антитіл.
У нормальній плазмі більшість мікрочастинок (до 80%) походять з тромбоцитів, тоді як інші походять з ендотелію і лейкоцитів (Caby M.P., 2005). У таблиці 1 представлені результати оцінки експресії CD19 та CD20 поверхневих антигенів одночасно на лімфоцитах та на мікрочастинках у п'яти донорів.
Таблиця 1 Відсоток вмісту CD19 та CD20-позитивних мікрочастинок та лімфоцитів у плазмі крові здорових донорів.