Біотехнологія способи отримання та культивування протопластів

Протопласти рослинних клітин як об'єкт біологічного конструювання

Способи отримання та культивування протопластів

Виділення протопластів

Протопласт – клітина, позбавлена целюлозної оболонки, оточена цитоплазматичною мембраною, що зберігає всі властивості, властиві рослинній клітині. Вперше протопласти в 1892 р. виділив Дж. Клеркер, який використовував механічний спосіб. При цьому способі у плазмованих клітин розрізають клітинну стінку, протопласти виходять у середу. В даний час метод зазнав модифікації, покращений, але має низку обмежень:

невисока продуктивність,
можна використовувати тканини тільки з екстенсивним плазмолізом,
трудомісткість та тривалість.

Інший метод виділення протопластів -ензиматичний, з використанням ферментів. 1952 року Салтон за допомогою ферменту лізоциму вперше зруйнував клітинну стінку бактерій. У 1960 році Коккінг обробив кінчики коренів томату гідролітичним ферментом з культуральної рідини цвілевих грибів (Myrothecium verrucaria) і вперше отримав ізольовані протопласти вищих рослин ензиматичним способом.

Переваги ензиматичного методу порівняно з механічним:

одночасно виділяється велика кількість протопластів (до 10 млн. з грама тканини або клітин),
клітини не зазнають сильного осмотичного стресу,
клітини не ушкоджуються,
метод порівняно швидкий.

Для видалення клітинної стінки використовують ферменти трьох типів: целюлази, геміцелюлази та пектинази. Комбінація ферментів та його співвідношення специфічно кожному за типу клітин.

Виділення протопластів проводять у триетапу:

обробка ферментами,
виділення протопластів із клітинних стінок,
відділення інтактних протопластів від клітинних уламків.

Стандартна методика протопластів (по Такебі) з тканин листаNicotiana tabacum:

Зрілий лист, що сформувався, відокремлюють від дорослої рослини у віці 60 - 80 днів, занурюють у 70% етанол, а потім поміщають на 15 - 20 хвилин у 10% розчин гіпохлориту кальцію і багаторазово промивають дистильованою водою. За допомогою пінцету нижній епідерміс знімають, очищене від епідермісу листя розрізають скальпелем на невеликі шматочки площею 4 кв. див. Для кращого зняття епідермісу листя повинне трохи підв'яти, можна також обмежити постачання водою перед зрізанням листя.

Далі тканину обробляють послідовно або одночасно пектиназою, що викликає мацерацію, і целюлазою, що руйнує клітинні стінки. Оптимальна концентрація ферментів, як і час обробки, є індивідуальними для різних тканин. Протопласти повинні знаходитися в розчині ферментів мінімальну кількість часу, після чого слід ретельне промивання. Ферменти стерилізують через бактеріальні фільтри.

Регуляція водообміну клітин пов'язана з наявністю клітинної стінки. Коли протопласт "голий", один із компонентів регуляції водообміну втрачається, тому важливого значення набувають осмотичні властивості середовища виділення та культивування. Середовище має бути трохи гіпертонічним, щоб протопласти знаходилися в злегка плазмолізованому стані. Ці умови гальмують метаболізм та регенерацію клітинної стінки. Як осмотичні стабілізатори використовують цукру (глюкозу, маніт, сорбіт, ксилозу), іонні осмотики (CaCl2, KCl) у концентрації 0,3 - 0,8 моль/літр. Концентрації підбираються індивідуально для кожногорослинного об'єкту.

Зручніше обробляти тканини ферментами у чашці Петрі, яку тримають під кутом 15 о . Суміш ферментів із протопластами переносять у центрифужні пробірки. Відокремити протопласти від ферментативної суміші можна двома способами: або фільтрація з центрифугуванням або флотація.

При фільтрації суміш пропускають через фільтри з розмірами пор 40 мкм. На фільтрі при цьому залишаються грудки клітин та їх великі уламки. При подальшому центрифугуванні осідають протопласти, уламки залишаються в супернатанті. При повторному центрифугуванні йде відмивання ферменту, після чого протопласти переносяться в середу для культивування.

Метод флотації запропонований О. Гамборгом із співробітниками у 1981 році, і призначається для ослаблених протопластів. Він заснований на тому, що протопласти мають нижчу густину, ніж органели або залишки клітинних стінок. До вихідної суміші додають розчин сахарози та центрифугують при швидкості від 40 – 80 до 350 g. Чисті протопласти плавають, уламки осідають на дно.

Протопласти можна виділяти також із суспензійних та клітинних культур. Найкраще – у пізній стадії логарифмічного зростання, коли клітинні стінки легше піддаються руйнуванню, протопласти найбільш життєздатні.

Далі протопласти культивують у тих-таки умовах, як і клітини. Склад солей може бути змінений. Середовище складається з осмотичного стабілізатора, неорганічних сполук, джерела вуглецю, азоту, вітамінів, фітогормонів. Умови культивування: рН середовища 5,4 - 5,8, температура 22 - 28 про, невисока освітленість (не більше 2000 лк).

Способи культивування протопластів

Існують два способи культивування протопластів: метод рідких крапель та метод платування.

У першому випадку суспензіюпротопластів у вигляді крапель поміщають на пластикові чашки Петрі. Варіацією цього способу є культивування поодиноких ізольованих протопластів у мікрокраплях об'ємом 1 мкл, запропоноване Ю. Глібою в 1978 році.

У другому - суспензію протопластів наливають у пластикові чашки Петрі, додають рівний обсяг того ж середовища з 1% агаром при температурі не вище 45 о С. Після остигання чашки Петрі перевертають і культивують при 28 про С. У даному випадку протопласти фіксовані в одному положенні фізично відокремлені один від одного. Це дає можливість спостерігати за розвитком інтактного протопласту: формуванням клітинної стінки, поділом, зростанням та розвитком рослини. Варіантом цієї техніки є використання протопластів або клітин, що годують, підданих впливу рентгенівського або γ-випромінювання, що блокує їх здатність до поділу. Такі протопласти або клітини змішують із життєздатними протопластами і вони підтримують та стимулюють їх зростання.

Відразу після видалення розчину ферменту починається утворення клітинної стінки. Важче домогтися поділу клітин та регенерації рослин. Регенерація рослин здійснюється або через ембріогенез, або через розвиток калюсу з подальшою індукцією морфогенезу. Домагаються цього додаванням в середу ауксинів або поєднання ауксинів із цитокінінами.

На проліферацію клітин, що виникли з протопластів, впливають 4 фактори:

видова специфічність та фізіологічний стан вихідної тканини рослини,
спосіб та умови виділення протопластів,
щільність висіву протопластів,
склад живильного середовища.