Холерний бактеріофаг 7106 для виготовлення діагностичних препаратів
Республік (11р 5 892 54
З 12 До 7/00 е оірдарвтеєїниі іомітет
Ради її ІІІ атрео СРСР ІО ІОЛА ІОООРЕТІЇ і атирктій (53) УДК 576.858 »9 (088.8) (72) Автори іеобрйт ня м с. Дрожевкіна, в. Олександрова і (0. І. Арутюн в
pl) заявник ростовський-на-дону державний науково-дослідний протичумний інститут (54) ХОЛЕРНИЙ БАКТЕРІОФАГ 7106 ДЛЯ ПРИГОТУВАННЯ
Винахід відноситься до медицини.
Відомий холерний бактеріофаг В ІЕ коленції Ашешкова (1). Він має відносно вузький діапазон дії і проявляє активність в основному на 5 холерні вібріони класичного біотипу.
Новий холерний бактеріофаг 7>06, має високу специфічність і відрізняється від холерного бактеріофага В 10 широким діапазоном літичної активності по відношенню до холерних вібріонів.
Холерний бактеріофаг 7106 виділений )5 в 1970 r sa випорожнень віброносія (збудник холери Ель Тор). В результаті послідовної селекції прозорих негативних колоній на щільному середовищі в поєднанні з 20 мульгенним дією УФ-променів і пасажами в ізольованій петлі тонкого кишечника морської свинки отриманий стабільний.вірулентний бактеріофаг 7106.
Холерний бактеріофаг 7106 для приготування діагностичних препаратів зберігається в колекції Ростовського-на Дону державного науково-дослідного протичумного інституту під номером 7106 і характеризується слі- @»
2 дующими морфологічними та фізіологічними ознаками.
Морфологічні ознаки ° Бактеріофаг має багатогранну голівку, в проекції гексагональної форми, розміром
500 30х450 30А і відросток з чохлом, що скорочується, довжина 1010 30 А і шириною 137+15 А. По морфології частки фаг 7106 відноситься до,y групі, згідно з класифікацією A. С.Тихоненко.
Фізіологічні Ітризнаки. Формування негативних колоній Двошаровий агар Мартена (рН 7,6), приготовлений за методом Граціа з індикаторною культурою вібріона Ель Тор штам 75 М. Через 18 24 годину інкубації при 37 C колонії фага прозорі, правильної округлої форми з чітко контурованим рівним краєм, діаметр 1,5мм.
Серологічні властивості. Належить до Y серологічного типу холерних фагів з вітчизняної "класифікації".
Антигенні властивості. При введенні кроликам викликає вироблення специфічних антитіл проти фагів типу: Антигенні властивості бактеріофага 7106 стабільні. Титр сироватки 1:250, еа
5 хв нейтралізує 1004 корпускул мологічного фага. Титр бактріофага
7106 по Граціа 10, по Аппельману
10". Продуцентами бактеріофага є спеціально підібрані нелізогенні штами нібріонів Ель Тор. Оптимальна множинність інфекції
005-0,5. Тривалість одиночного циклу розвитку 24 хв. УрожайвЂ"
60 корпускул на батькові мікробну клітину. , Специфіка ° Строго специфічний.
Не лізує мікробів інших відон.
Діапазон літичної активності у межах гомологічного виду мікробів.
Бактеріофаг має широкий діапазон атітичної дії на вібріони.
Корисність винаходів полягає в тому, що за допомогою бактеріофага 7106 здійснюється приготування нових
Фагових препаратів для діагностики та
Ідентифікації збудника сучасної холери Ель Тор.
П р і м е.р 1. Для приготування діагностичного холерного фага;ис-25 користують фаг 7106 у вигляді монофага. Для цього фаг 7106 у кількості 4 мл вносять у флакон з 200 мл бульйону Мартена (рН 7,6) і одночасно додають
2 мл 3-годинної бульйонної культури хо- 30 лернихвібріонів біотипу Ель Тор штам
75 М. Через 3 годину інкубації при 37оС вміст флакона фільтрують через фільтр Зейтца з азбестовою стерилізуючою пластиною для звільнення від мік-З5 робових клітин. Приготовлений препарат фага 7106 (фільтрат) перевіряють на специфічну та неспецифічну стерильність та активність відомими методами. Визначають титр фага методом агарових шарів Граціа. Для цього розтоплений, остуджений до 45 С > і розлитий по пробірках напіврідкий агар вносять 0,2 мл 3-годинний бульй.;ний культури чутливого штаму холерних вібріонон. У цю суміш вносять 1 мл Фага в розведеннях 10 і 10. Вміст пробірки перемішують та виливають на поверхню 1,5 агару у чашці Петрі.
Після застигання агару чашки поміщають у термостат при 37 С і через 12 - @
18:00 враховують кількість негативних колоній фага. Титр діагностичного фага має бути не нижчим і 106.
Отриманий у такий спосіб діагностичний фаг 7106 використовують для швидкого визначення холерних вібріонів. Холерний діагностичний фаг використовують нерозведений. Для цього пастерівською піпеткою або платиновою петлею (діаметром 5 мм) наносять краплю @ цільного Фага 7106 на газон, приготований двошаровим методом іе 3-годинної культури підозрюваного на холерні вібріони штаму. Через 6-12 годину інкубації при 37 С» 65 ведуть облік результатів за наступною схемою:
++++ вЂ" повний лізис культури на місці нанесення фага;
+++ вЂ" добре виражений лізис і слабке вторинне зростання;
++ вЂ" виразний лівіс з більш рясним вторинним зростанням або поодинокі негативні колонії;
+ вЂ" слабкі сліди ліеїсу і рясне вторинне зростання на місці нанесення фага; вЂ" вЂ,слідів лівіса культури немає °
Позитивним вважається лізис культури на++++, +++ та ++. Досліджувана культура не може бути визнана холерною при результатах оцінюваних на + і вЂ. Використання діагностичного монофага 7106 для визначення виду 480 вібріонових штамів Ель Тор, виділених в різних вогнищах холери, дозволило швидко протягом 6-12 годину визначити приналежність до холерних вібріонів 474 штамів иэ 480 досліджених (98,7%).
Використання фагу Ель Тор, що застосовується для цієї мети, дозволило правильно діагносцювати лише 415 штамів (86,4%).
П р е р 2. Спосіб використання фага 7106.для отримання антифагової сироватки.
Приготування антигену-фага для імунізації тварин проводиться наступним чином: Фаг 7106 у кількості 4 мл вносять у флакон з 200 мл бульйону Мартена (рН 7,6) і одночасно додають 2 мл 3-годинної бульйонної культури холерних вібріонів Ель
Тор штам 75 М. Через 3 годину інкубації при 37 С вміст флакона фільтрують через фільтр Зейтца з азбестовою пластиною, що стерилює, для звільнення від мікробних клітин. Приготовлений фаг 7106 (фільтрат) перевіряють на специфічну та неспецифічну стерильність відомими методами та визначають його титр. Як антиген використовують фаг з титром п 10 .
Для імунізації використовують дорослих кролів вагою 2,5-3 кг. Фаг стерильно вводять шприцом у крайову вену вуха кролика. Імунізацію кроликів роблять трьома циклами по чотири ін'єкції фага в кожному циклі. Фаг 7106 вводять н наступній кількості:
1 ін'єкція 2 мл Фага
2 ін'єкція 4 мл фага
3 ін'єкція б мл фага
4 ін'єкція 8 мл фага.
Інтервал між ін'єкціями 4-5 днів між циклами 10-14 днів. Через 14 днів після останньої ін'єкції фага на третьому циклі проводять тотальне знекронення кролика шляхом взяття стерильно (шприцом) крові з серця.
Після відстоювання та згортання формених елементів крові за допомогою стерильної піпетки відсмоктують сироватку.
Упорядник Н.. Бондаренко Техред N.Êåëåìåø
Коректор С. Ямалова
Замовлення 340/18 Тираж 568 Передплатне
ПНДІПД Державного комітету Ради Міністрів СРСР у справах винаходів та відкриттів
113035, Москва, Ж-35, Рауська наб., д. 4/5
Філія ППП Патент, м. Ужгород, вул. Проектна, 4 ку крові та розливають її по ампулах у стерильних умовах. Здатність антифагової сироватки пригнічувати літичну активність фагів/типу встановлюють шляхом визначення її титру методом Адамса 91961). Для цього антифагову сироватку послідовно розводять двократними розгалуженнями в бульйоні Мартена (рН 7,6) починаючи з розведення 1:25; 1:50 і т.д. фаг 7106 розводять в бульйоні так, щоб в 1 мл містилося п 10" корпускул. протягом 5 хвилин З цієї суміші переНосНТ 0,1 мл в 9,9 MJI холодного бульйону, ретельно перемішують і 0,1 мл цього розведення вносять в 3,5-4 мл напіврідкого агару (0,5-0,7 %), розплавленого та остудженого до 45 С, куди додають 0,2 мл 3-годинної бульйонної культури індикаторного штаму вібріона Ель-Тор 75 М. Ретельно пе(емеши25 вають і виливають другим шаром на поверхню щільного (1,5-2%) arapa в чашку Петрі Одночасно всі маніпуляції проводять з контролем, де замість антифагової сироватки застосовують фізіологічний розчин.
18-24 годину інкубації при 37ОС підраховують кількість негативних колоній на дослідних та контрольному посівах.
З цих даних становлять рівняння і обчислюють відсоток нейтралізації фага. При цьому кількістьнегативних колоній фага у контролі приймається за 100%. Граничне розведення сироватки, яке повністю нейтралізує гомологічний фаг, приймається за титр антифагової сироватки. Отримана таким способом антифагова сироватка використовується для визначення типу холерних фагів серед свіжовиділених рас фага, для ти- 45 пізації фагів у прямому методі фаготипування вогнище в холери і при бактеріологічному дослідженні на холеру в осередках, де циркулює лізогенний різновид. 50
Холерний бактеріофаг 7106 для виготовлення діагностичних препаратів. Зберігається в колекції Ростовськоро-на-Дону державного науково-дослідного протичумного інституту під номером 7106.
Морфологічні ознаки Бактеріофаг 7106 має багатогранну голівку, s проекції гексагональної форми, розміром 500 30х450 30 A і відросток з чохлом, що скорочується, довжиною 1010+30 А і шириною 137 15 А. За морфологією частинки фаг 7106 відносяться до V груп-С Т-х Т-100. .
Фізіологічні ознаки, формування негативних колоній. Двошаровий агар Мартена (рН 7,6), приготовлений за методом Граціа з індикаторною культурою вібріона Ель Тор штам 75 М, Через 18-24 годину інкубації при 37 С колонії фага прозорі, правильної круглої форми з чітко контурованим рівним краєм, діаметр -1,5мм.
Серологічні властивості. Належить до l серологічного типу холерних фагів за вітчизняною класифікацією.
Антигенні властивості. При введенні кроликам викликає вироблення специфічних антитіл проти фагів, V типу
Антигенні властивості бактеріофага 7106 стабільні. Титр сироватки 1:250, за
Оптимальна множина інфекції 0,05-0,5.
Тривалість одиночного циклу розвитку 24 хв. Урожай вЂ" 60 корпускулодну мікробну клітину.
Специфіка. ;троє специфічний.
Чи не ліеює мікробів інших видів.
Діапазон літичної активності у межах гомологічного виду мікробів.
Бактеріофаг має широкий діапазон політичної дії на вібріо»ни Ель Тор.
Джерела інформації, прийняті до уваги при експертизі:
1. The 3ndinn jOurnat cj. med(ca! тавас т сЬ., 193Ú, v. 20, р. ІО1.