III.3.3.3. Метод внутрішнього стандарту
Метод внутрішнього стандарту (еталону) у традиційному варіанті передбачає додавання до відомої кількості аналізованого зразка відомої кількості еталонної сполуки, що не міститься в ньому, «внутрішнього стандарту» і подальше хроматографування приготовленої суміші.
Зміст компонентів в аналізованому зразку [%(за масою або за обсягом)] знаходять за формулою:
де Рi, Рст - вимірювані параметри хроматографічних піків цікавого і стандартного речовин (площі, висоти або добутку висот на час утримування); речовини*; qст, qсм-кількості стандартної речовини та аналізованої суміші (г, моль або мл), відібрані і змішані для виконання аналізу.
Якщо підготовлену до аналізу пробу перед хроматографуванням розбавляють стороннім розчинником, то його кількість (ступінь розведення) не позначається на результатах і розрахунковою формулою не враховується.
Іноді, проте, зручніше розбавляти розчинником порції суміші, що аналізується, і стандартного з'єднання окремо і змішувати аліквоти приготовлених розчинів. У цьому випадку необхідно строго враховувати кількості розчинника для того, щоб ввести в розрахункову формулу коефіцієнти, що відображають різний ступінь розведення суміші, що підлягає аналізу, і стандартної сполуки.
Гідність методу внутрішнього стандарту полягає в тому, що при його використанні зводяться до мінімуму похибки в результатах, спричинені випадковими змінами основних параметрів хроматографічного досвіду (температури та швидкості газу-носія та режиму роботи детектора), оскільки можливі відхилення від заданих умовповинні також впливати на кількісні параметри хроматографічних піків як стандартного, так і аналізованого сполук. Відпадає необхідність дозування строго заданих кількостей проби та дотримання сталості всіх змінних параметрів хроматографування.
Поряд з цим виявляється можливим отримувати рівноточні результати як зіставленням площ або творів висот піків на час утримання компонентів, так і зіставленням висот піків компонента, що цікавить, і стандартної речовини (при обробці хроматограм вручну це призводить до значної економії часу).
Оскільки техніка розшифровки хроматограм зводиться до вимірювання параметрів хроматографічних піків цікавого та стандартного з'єднань, умови хроматографування повинні забезпечувати по можливості повне їх поділ; всі інші складові вихідної проби в прийнятих умовах аналізу можуть не відокремлюватись один від одного або навіть взагалі не виявлятися на хроматограмі (у цьому полягає перевага методу внутрішнього стандарту перед методом внутрішньої нормалізації).
Головні обмеження застосування методу внутрішнього стандарту полягають, по-перше, у необхідності спеціальної підготовки проби для аналізу (тобто введення у відому за обсягом або масою кількість зразка відомої кількості внутрішнього стандарту, що аналізується, — при цьому важко уникнути похибок, пов'язаних з можливою зміною складу проби) і, по-друге, у складності вибору внутрішнього стандарту.
* Способи знаходження величинfiі випадки, коли їх чисельне значення можна прирівняти 1, розглянуті в попередньому розділі.
При виборі внутрішнього стандарту зазвичай керуються такими вимогами.
1. Стандартна (еталонна) речовинаповинно повністю змішуватися з компонентами аналізованої суміші (розчинятися в ній) і в хімічному відношенні має бути абсолютно інертним і до компонентів аналізованої суміші, і до нерухомої фази, що використовується або твердому носію.
Бажано стандартну речовину вибирати з-поміж сполук, близьких об'єктам аналізу за структурою та летючістю. Це виключає можливий різний вплив умов досвіду на параметри піків стандарту та з'єднань, що визначаються.
Концентрацію еталонної речовини в аналізованій пробі слід підбирати таким чином, щоб відношення площ (або інших кількісних параметрів) піків стандарту та компонента, що цікавить, було близьким до одиниці.
У прийнятих умовах аналізу пік стандартної речовини повинен розташовуватись на хроматограмі в безпосередній близькості від піків сполук – об'єктів аналізу, не накладаючись ні на них, ні на піки інших речовин*.
4. Якщо завдання аналізу включає визначення вмісту в пробі двох або більше речовин, що значно різняться за часом утримання (або за концентрацією), доцільно використовувати два або більше внутрішніх стандартів.
Варіант методу внутрішнього стандарту – метод стандартної добавки. Якщо вибір речовини-стандарту з урахуванням перерахованих вище вимог утруднений, можливе і виправдане використання як стандарту сполук, які вже присутні в аналізованій суміші.
У цьому випадку в однакових умовах одержують дві серії хроматограм: а) вихідної аналізованої суміші і б) порції суміші qсм з доданою до неї відомою кількістюдстодного з компонентів, що грає роль стандартного з'єднання .
* При цьому кожен стандарт використовується для розрахунку концентрації найближчого до нього за часом утримання компонентасуміші. Нещодавно було запропоновано використовувати два або навіть більше стандартів для розрахунку концентрації кожного компонента, що визначається; докладніше про цей новий метод, який отримав назву «метод подвійного стандарту», див. розділ111,3.4.
Вміст у вихідній суміші компонентів, що цікавлять, і речовини-стандарту[%(за масою)] розраховують за формулами
де qсм, qст-кількості відібраної для аналізу порції суміші і введеного в неї стандарту, г;Pi1, Pст1, Pi2, Pст2- кількісні параметри піків цікавого або реперного компонента та речовини-стандарту на хроматограмах першої та другої серії відповідно;fi— нормувальний (градуювальний) множник для компонента, що цікавить, щодо речовини-стандарту (приймається, щоfст=1).
За умови лінійності детектора точність одержуваних результатів не гірша, ніж у методі внутрішньої нормалізації.
Більш загальний випадок використання методу стандартної добавки, коли як стандарт застосовується речовина, не тільки присутня в аналізованій суміші, але і містить деяку кількість домішок - сполук, що також присутні в суміші, розглянутий у роботі 1711.