Імунологічні реакції
Імунологічні реакції використовуються для виявлення специфічних антитіл, ідентифікації збудників та інших антигенів, визначення груп крові та підбору адекватного донора при пересадках органів та тканин.
Серологічні реакції- реакції між антигенами та антитілами in vitro - застосовують для виявлення невідомого антигену або антитіла за допомогою відомого антитіла або антигену відповідно. Корпускулярні антигени дають феномен аглютинації, розчинні преципітації. У лабораторній практиці використовують реакції аглютинації, преципітації, зв'язування комплементу та ін.
Антигени, якими окремі індивідууми чи групи особин одного виду різняться між собою, є изоантигенами. Ізоантигени, генетично пов'язані, об'єднані в групи, що отримали назви: система АВО, резус та ін.
У плазмі людини завжди містяться природні, повні, холодові ізоантитіла до аглютиногенів А і В. Аглютинін анти-А - a-аглютинін, а аглютинін анти-В - b-аглютинін.
Визначення групи крові (визначення аглютиногену). Реакцією аглютинації за допомогою стандартних сироваток визначають групові аглютиногени в еритроцитах. Ампули або флакони зі стандартними сироватками двох різних серій кожної групи ставлять у 2 штатива, що мають по 3 гнізда, або в 1 штатив із двома рядами гнізд. Зліва направо ставлять сироватки груп 0 α-b (I), А b (II), α (III). Окремо ставлять сироватку АВ0 (IV). Визначення виробляють на білих пластинах чи тарілках. На лівій стороні роблять написи 0 α-b, в середині - А b, праворуч - В α. Під відповідним написом наносять по 0,1 мл кожної стандартної сироватки окремою для кожної сироватки піпеткою. Кров для дослідження беруть із пальця, 0,01 мл крові сухою скляною паличкою наносять поряд з кожноюкраплі стандартної сироватки. Перемішують краплі стандартної сироватки з досліджуваною кров'ю. Після цього пластину похитують, потім на 1-2 хв залишають у спокої і знову періодично похитують. Спостереження за перебігом реакції проводять не менше 5 хв, незважаючи на те, що аглютинація починається протягом перших 10-30 сек., так як можлива пізня аглютинація, наприклад еритроцитами групи А2 (II). У міру настання аглютинації, але не раніше ніж через 3 хв, у краплі, в яких настала аглютинація, додають ізотонічний розчин хлориду натрію і продовжують спостереження при похитуванні пластинки протягом 5 хв, після чого оцінюють результат. При позитивній реакції в суміші з'являються видимі неозброєним оком дрібні червоні зернятка (аглютинанти), що складаються зі склеєних еритроцитів. При цьому сироватка повністю або частково знебарвлюється. У разі негативної реакції протягом всього часу спостереження (5 хв) рідина залишається рівномірно забарвленою в червоний колір, і в ній не виявляються аглютинати. Результати реакції у краплях із сироватками однієї групи обох серій мають бути однаковими.Можливі різні комбінації реакцій:
1) сироватки всіх трьох груп дали негативну реакцію - випробувана кров належить до групи 0(I);
2) сироватки груп 0 α-b (I) та В α (III) дали позитивну реакцію, а сироватка групи А b (II) - негативну: випробувана кров належить до групи А (II);
3) сироватки групи 0 α-b (I) та А Я (II) дали позитивну реакцію, а сироватка групи В α (III) - негативну: випробувана кров належить до групи В (III);
4) сироватки всіх груп дали позитивну реакцію. У цьому випадку для виключення неспецифічної аглютинації проводять додаткове контрольне дослідження зстандартною сироваткою АВ0(IV).
Відсутність аглютинації у краплі цієї сироватки за наявності її у всіх інших дозволяє віднести кров до групи АВ0(IV). Наявність аглютинації із сироваткою групи АВ0 (IV) говорить про неспецифічну аглютинацію. У цих випадках слід дослідження повторити з відмитими еритроцитами.
Визначення повної групової формули крові (аглютиногенів та аглютинінів). Одночасне визначення групових антигенів еритроцитів та аглютиногенів сироватки дозволяє встановити повну групову формулу крові, що досліджується. Для цього беруть 2 різні серії стандартних сироваток груп крові 0 α-b (I), А b (II), α (III), АВ0 (IV); 0,85%-ний розчин хлориду натрію; стандартні еритроцити груп 0(I), А(II), В(III). У центрифужну пробірку, що містить 0,25-0,5 мл 3,8% розчину цитрату натрію, додають 2-4 мл крові спеціально відібраних донорів, потім пробірку на 3/4 заповнюють ізотонічним розчином хлориду натрію. Перемішують, центрифугують і залишають стояти до осідання еритроцитів. Відмиті стандартні еритроцити зберігають у холодильнику. Термін придатності – 2-3 дні. Ампули зі стандартними сироватками двох різних серій кожної групи ставлять у 2 штативи. Окремо ставлять сироватку АВ0 (IV). Пробірки зі стандартними еритроцитами встановлюють в окремий штатив з трьома гніздами в порядку: група 0 (І), А (ІІ) та В (ІІІ). На платівці роблять написи зліва направо: 0 α-b , А b і для стандартних сироваток і 0, А і В - для стандартних еритроцитів. Під відповідними позначеннями наносять по 1 великій краплі всіх стандартних сироваток і 1 маленькій краплі стандартних еритроцитів. Досліджувану кров відділення сироватки центрифугують чи залишають стояти 20—30 хв. Досліджувану сироватку по 1 великій краплі капають на підготовленістандартні еритроцити. Після цього тією ж піпеткою набирають з дна еритроцити крові, що досліджується, і наносять їх по 1 маленькій краплі поряд з кожною краплею стандартної сироватки. Сироватку ретельно перемішують із еритроцитами сухими скляними паличками. Через 1 хв у краплі, в яких настала аглютинація, додають ізотонічний розчин хлориду натрію і продовжують спостереження при похитуванні пластинки до закінчення 5 хв.
Можливі варіанти реакцій:
1) реакція зі стандартними сироватками свідчить про відсутність аглютиногенів, тобто. на належність досліджуваної крові до групи 0(І). При цьому сироватка досліджуваної крові дає негативну реакцію зі стандартними еритроцитами групи 0 (I) і позитивну з еритроцитами груп А (II) і В (III);
2) реакція зі стандартними сироватками вказує на наявність у досліджуваній крові аглютиногену А. При цьому сироватка досліджуваної крові дає негативну реакцію зі стандартними еритроцитами груп 0 (I) та А (II), але позитивну – з еритроцитами групи В (III);
3) реакція зі стандартними сироватками вказує на наявність у досліджуваній крові аглютиногену В. При цьому сироватка досліджуваної крові дає негативну реакцію зі стандартними еритроцитами груп 0 (I) та В (III), але позитивну – з еритроцитами групи А (II);
4) реакція зі стандартними сироватками вказує на наявність у досліджуваній крові аглютиногенів А і В. При цьому сироватка досліджуваної крові дає негативну реакцію зі стандартними еритроцитами всіх трьох груп, тобто. не містить аглютинінів.
Визначення резус-фактора методом конглютинації із застосуванням желатину. Досліджувані еритроцити інкубують зі стандартною сироваткою антирезус, що містить неповні антитіла-резус, в колоїдному середовищі - розчині желатину. Якщодосліджувані еритроцити резус-позитивні, відбувається їх склеювання - конглютинація, яка виявляється після додавання до інкубаційної суміші ізотонічного розчину хлориду натрію. Резус-негативні еритроцити не склеюються.
Для реакції використовують: стандартні сироватки антирезус з неповними антитілами двох різних серій (група стандартної сироватки повинна бути сумісна з групою досліджуваної крові), 10% розчин желатину в ампулах заводського виготовлення, 0,85% розчин хлориду натрію, 3,8 %-ний розчин цитрату натрію, стандартні еритроцити контролю.
В одну пробірку вносять 0,05 мл еритроцитів, що досліджуються. В іншу пробірку поміщають 0,05 мл стандартних резус-позитивних еритроцитів групи 0 (I) або групи, однойменної з кров'ю, що досліджується. У третю пробірку - по 0,05 мл стандартних резус-негативних еритроцитів тієї ж групи, що і кров, що досліджується. Потім у всі пробірки додають по 0,1 мл 10% розчину желатину, попередньо підігрітого до 48 °С. Злегка струшують для перемішування. Після цього в першу пробірку вводять 0,1 мл антирезус сироватки однієї серії, в другу - по 0,1 мл сироватки антирезус другої серії. Вміст пробірок перемішують струшуванням і всі пробірки поміщають у водяну баню при 48 °С на 5 хв або термостат за тієї ж температури на 30 хв. Після прогрівання доливають по 8-10 мл підігрітого ізотонічного розчину хлориду натрію, вміст пробірок перемішують і потім переглядають неозброєним оком або через лупу.
Коли кров резус-позитивна, у пробірці спостерігаються легко помітні червоні зерна або пластівці, що складаються зі склеєних еритроцитів, на прозорому, майже знебарвленому тлі. Якщо еритроцити резус-негативні, у пробірці видно рівномірно забарвлену в рожевийколір, злегка опалесцентна рідина.
Результати слід вважати дійсними при збігу їх в обох серіях стандартної сироватки-антирезуси. У контрольних зразках стандартні резус-позитивні еритроцити однойменної групи або групи 0 (I) із сироваткою-антирезус повинні дати позитивний результат, а стандартні резус-негативні еритроцити однойменної групи - негативний. З іншого боку, негативний результат може бути у всіх пробірках третього ряду, тобто. без сироватки-антирезус.
Визначення неповних антитіл
Як ізоантители, так і аутоантители можуть відноситися теплові антитіла (оптимум дії при 37 °С), головним чином, класу IgG. Вони називаються неповними, унівалентними і, покриваючи поверхню еритроцитів, не викликають їхню аглютинацію в сольовому розчині, проте можуть склеювати еритроцити в середовищі з високою концетрацією білка (альбуміну або сироватки). Теплові антитіла класу IgG рідко мають здатність фіксувати комплемент, викликаючи лізис еритроцитів, тобто. виступати як гемолізини. Зазвичай еритроцити, покриті антитілами IgG, секвеструються селезінкою, де вони втрачають частину оболонки, що призводить до фрагментації та сфероцитозу, або аглютинують (в середовищі з високою концентрацією білка) і захоплюються макрофагами. Фіксовані на еритроцитах неповні антитіла виявляються прямою пробою Кумбса (антиглобулінової пробою). Суть методу полягає в аглютинації еритроцитів, покритих антитілами класу IgG, антисироваткою кролика проти γ-глобуліну людини. Непряма проба Кумбса визначає неповні антитіла, що містяться в сироватці крові та можуть бути як аутоантитілами, так і ізоантитілами. У цій пробі еритроцити донора інкубують з сироваткою крові, що досліджується, потім відмивають і з'єднують з антиглобуліновою.сироваткою, тобто. проводять пробу Кумбса, і з її допомогою встановлюють, чи є поверхні донорських еритроцитів неповні антитіла. При позитивному варіанті відбувається аглютинація еритроцитів.
Визначення ристоміцин-агрегації (аглютинації) у багатій на тромбоцити досліджуваної плазмі відображає взаємодію фактора Віллебранда (ФВ) з власними тромбоцитами пацієнта. При дослідженні in vitro ристоміцин сприяє зв'язуванню ФВ із тромбоцитарним рецептором ГП1в. Процес агрегації, що індукується додаванням до багатої тромбоцитами досліджуваної плазми стандартної кількості ристоміцину, реєструється фотометрично за падінням її оптичної щільності. Вимірювання проводяться в агрегометрі або на модифікованому фотоелектроколориметрі, з перемішуючим і записуючим пристроями. Ристоміцин-агрегація тромбоцитів може знижуватись як при якісних, так і при кількісних дефектах ФВ.
Визначення активності фактора Віллебранда (ристоміцин-кофакторної активності - РКА) досліджуваної плазми засноване на його здатності викликати в присутності ристоміцину аглютинацію нормальних донорських тромбоцитів. У класичному методі, запропонованому H.I. Weiss пропонується використання суспензії свіжоприготовлених відмитих донорських тромбоцитів для вимірювань, що проводяться в агрегометрі. При цьому завись відмитих та ресуспендованих донорських тромбоцитів повинна мати концентрацію близько 250 ґ 109 /л. У кювету агрегометра додають завись доведеної досліджуваної бідною тромбоцитами плазми та стандартизовану кількість ристоміцину. Наступний агрегаційний процес реєструється протягом декількох хвилин за допомогою збільшення запису трансмісії. Кут нахилу отриманої кривої пропорційний РКА досліджуваного зразка плазми. РКА досліджуваної плазми визначаєтьсявідсотках за калібрувальною кривою залежності максимальної зміни трансмісії за хвилину від рівня РКА. Для її побудови використовується серія розведень стандартної комерційної або пульованої плазми, в яких РКА відповідає 100%, 50%, 25% рівню.
У модифікаціях даного методу передбачено використання свіжих, а фіксованих формаліном донорських тромбоцитів. Така обробка тромбоцитів сприяє тривалому їх зберіганню без втрати рецепторів до ФВ. Для цього з донорської крові, взятої на ЕДТА-формаліновому розчині (сіль етилендіамінтетраоцтової кислоти) у співвідношенні 9: 1, готується бідна тромбоцитарна плазма. Отриманий після видалення тромбоцитарний осад двічі відмивається ЕДТА-буферним розчином і розводиться в буфері до концентрації тромбоцитів 200-250 ґ 109/л. Отриманий тромбоцитарний реагент може зберігатись.
В даний час комерційно доступні тест-набори, засновані на реєстрації аглютинації фіксованих ліофілізованих тромбоцитів як методами агрегатометрії, так і слайд-тестами. Визначення РКА у слайд-тестах потребує менших витрат часу та характеризується вищою точністю.