Кювет - спектрофотометр -Велика Енциклопедія Нафти та Газа, стаття, сторінка 1
Кювет – спектрофотометр
Кювети спектрофотометра заповнюють середовищем, що містить фосфатний буфер (рН 7 4), 1 мМ KCN, 1 мкМ ротенон, 1 5 мМ НАДН, 10 - 20 мкМ цитохром с. Встановлюють довжину хвилі 550 нм ( точно. Цитохром з негайно відновлюється, і розчин змінює колір від червонувато-жовтогарячого до яскраво-рожевого. Встановлюють шкалу довжин хвиль на 550 нм за максимальним поглинанням розчину відновленого цитохрому з, при подальшій роботі. Реакцію починають внесенням препаратів в кювету, що містить окислений цитохром з, і реєструють збільшення поглинання при 550 нм. у присутності та відсутність ротенону.
Кювети спектрофотометра заповнюють середовищем, що містить 60 мМ КС1, 20 мМ трис - HCl і НАДН так, щоб поглинання середовища при 340 нм не перевищувало 1 од. [2]
Кювети диференціального спектрофотометра мають об'єм 10 – 15 мкл. Спектрофотометричний детектор рідинного хроматографа ХЖ-1305, розроблений в ВКВ АП АН СРСР за схемою С. В. Кузьміна, має кювету об'ємом не більше 15 мкл. [3]
Якщо кювета спектрофотометра термостатирована, визначають оптичну щільність багаторазово, доки буде досягнуто постійна її величина, що свідчить про досягнення температурного рівноваги. [4]
У кювету спектрофотометра поміщають 1 мл робочого розчину і прогрівають 5 хв при 37 С. Додають 0 1 мл аналізованої проби (сироватки, плазми), перемішують і інкубують 1 хв при 37 С. Вимірюють оптичну щільність розчину по відношенню до повітря або води. [5]
У кюветуспектрофотометра поміщають 2 мл середовища вимірювання активності. Включають прилад і виводять перо самописця крайнє положення. Переконавшись у тому, що відсутність ферменту не відбувається зміни оптичної щільності середовища, додають 10 мкл розведеного препарату СУР і реєструють відновлення СВ, пов'язане з сукцинат: убихинон-редуктазной реакцією. Додають 002 мл 20 мМ ТТА, при цьому активність СУР різко гальмується. Розраховують каталітичну активність ферменту в мікромолях окисленого сукцина в хвилину на 1 мг білка і ступінь гальмування реакції ТТА. [6]
У кювету спектрофотометра наливають дистильовану воду та встановлюють нуль приладу при 520 нм. [7]
У кювету спектрофотометра поміщають 20 мл глицил-глицинового буфера, 075 мл хлористого магнію, 01 мл НАДФ і 01 мл досліджуваного розчину. Перемішують і вимірюють оптичну густину при 340 нм щодо контрольної кювети, що містить замість досліджуваного розчину 0 1 мл бидистиллированной води. Потім обидві кювети додають по 0 05 мл розчину ферменту. Проби швидко перемішують та визначають збільшення оптичної щільності до повного припинення реакції. [8]
У кювету спектрофотометра наливають 0 1 мл Ы0 - 3 М розчину глутатіону і 2 7 мл 0 5 М К. Потім послідовно ще 5 - 6 разів додають по 0 02 мл розчину, вимірюючи щоразу (через кілька хвилин) його оптичну щільність. Об'єм наступних порцій п - ХМБ зменшують до 0 01 мл. Додавання розчину продовжують доти, доки не припиниться наростання оптичної щільності при внесенні нових порцій/г – ХМБ. [9]
У кювету спектрофотометра поміщають 10 мл нейтралізованого екстракту тканини, 10 мл 005 М фосфатного буфера, 0 3 мл 0 1 М розчину семікарбазиду, 0 1 мл етилового спирту і воду до 2 95 мл. Реакціюпочинають додаванням 005 мл алкогольдегідрогенази. Реєстрацію наростання оптичної щільності припиняють, коли два останні відліки, зроблені з інтервалом 5 хв, збігаються. [10]
Наповнюють кювету спектрофотометра пофарбованим перманганатним розчином і вимірюють оптичну щільність щодо холостого розчину в окремій кюветі. Для отримання калібрувального графіка розчини готують так, як описано вище, але як окислювач використовують кислий розчин реагенту і персульфат амонію. [11]
У кювету спектрофотометра вносять 1 мл робочого розчину і прогрівають 5 хв при 37 С. Додають 0 1 мл аналізованої проби (сироватки, плазми), перемішують і інкубують 1 хв при 37 С. Вимірюють оптичну щільність розчину по відношенню до повітря або води. [12]
У кювету спектрофотометра вносять розчин білка і додають 5 - 10-кратний надлишок молярний ДТНБ над сульфгидрильными групами. Отриману суміш перемішують і через 5 - 10 хв вимірюють оптичну густину при 412 нм. Через 30 хв проводять повторний вимір оптичної щільності, використовуючи як контроль розчин, що містить однакову кількість ДТНБ, але не містить білка або низькомолекулярного тіолу. [13]
У кюветі спектрофотометра складають суміш, що складається з 0 1 М фосфатного буфера (рН 7 8), 10 мМ сукцинату, бичачого сироваткового альбуміну (1 мг/мл) та 2 мМ фериціаніду калію. [14]
Наповнюють дві кювети спектрофотометра/1 см цим розчином. В одну з них капають одну краплю розчину перекису водню та перемішують маленькою скляною паличкою. Вимірюють оптичну густину цього забарвленого розчину щодо розчину в іншій кюветі, куди перекис водню не додають. Вимірювання проводять в інтервалі 400 – 410 ім. [15]