ЛАБОРАТОРНА ДІАГНОСТИКА САПА, МЕЛІЙОДОЗУ І ПСЕВДОМОНОЗУ НОРОК
Мета заняття. Ознайомити студентів із властивостями збудників та лабораторною діагностикою сапу, меліоїдозу, псевдомонозу норок та біопрепаратами.
Устаткування та матеріали.КультуриP. aeruginosaна МПА у чашках Петрі, в МПБ, набір тестів, що характеризують ферментативні властивостіP. aeruginosa, покривне скло для препарату «роздавлена крапля», біопрепарати для специфічної профілактики та діагностики сапа та псевдомонозу норок.
Сап. Це інфекційна, хронічно протікає хвороба однокопитних тварин (коні, віслюки, мули, лошаки); сприйнятливі представники сімейства котячих та людей. Характеризується виникненням у легенях, на слизовій оболонці носа і різних ділянках шкіри специфічних вузликів, схильних до розпаду з утворенням виразок, що гнояться.
Збудник сапа - бактеріяPseudomonas mallei,рідPseudomonas,сімейство Pseudomonadaceae.
Лабораторна діагностика сапа заснована на результатах серологічних досліджень (РСК); бактеріологічне дослідження проводять у виняткових випадках.
Бактеріологічне дослідженнявключає виявлення збудника у вихідному матеріалі методом світлової мікроскопії і біопроби, виділення чистої культури посівом на поживні середовища та ідентифікацію збудника за культурально-морфологічними і ферментативними властивостями.
Матеріал для дослідження.До лабораторії направляють кров, гнійне виразок, що відокремлюється, носові виділення, пунктат лімфатичних вузлів, гній з абсцесів; від убитих тварин беруть ділянки ураженої тканини легень, печінки, селезінки, лімфатичних вузлів, носової перегородки, трахеї, бронхів та інших.
Мікроскопія препаратів з вихідного матеріалу.У мазках з матеріалу, пофарбованих за Грамом, збудник виявляють у вигляді прямих або злегка вигнутих, із закругленими кінцями грамнегативних паличкоподібних бактерій розміром (1,4. 4) х 0,5 мкм, без суперечок та капсул (рис. 108). При фарбуванні метиленовим синім Леффлера у клітинах видно зернистість.
Виділення та ідентифікація культури збудника.Збудник сапа -аероб, температурний оптимум 37. 38 ° С, рН 6,8. 7, краще росте на середовищах із додаванням гліцерину (2. 4 %). Досліджуваний матеріал висівають на гліцеринізованих МПА та МПБ. Зростання збудника з'являється на першу-другу добу, іноді пізніше.
У МПБ збудник росте з помутнінням середовища, на дні пробірки утворюється сіро-білий осад, на поверхні бульйону може з'являтися плівка. На МПА збудник формує гладкі, напівпрозорі, сірувато-білі, з перламутровим відтінком колонії, що поступово зливаються в слизовий наліт. З вирощених культур роблять мазки, фарбують за Грамом, при мікроскопії виявляють грамнегативні поліморфні палички; у бульйонних культурах клітини збудника коротші — аж до кокоподібних.
Характерним вважають зростання на гліцериновому картоплі: через дві - три доби з'являються дрібні, напівпрозорі, з жовтуватим відтінком колонії, які потім зливаються в наліт з жовтуватим відтінком («медовим»), до шостого-восьмого дня колір змінюється до буро-коричневого або червоного.
У бактерій із типовими для збудника сапу культурально-морфологічними властивостями вивчають ферментативні ознаки.P. malleiповільно, на 6. 8-а доба, згортає молоко, розріджує желатину, розщеплює з утворенням кислоти без газу глюкозу, лактозу, не утилізує сахарозу, мальтозу, маніт. Українах тропічної зони Південно-Східної Азії виділяють збудника «неправдивого сапу» (меліоїдозу, хвороби Уітмора) -P. pseudomallei, що викликає захворювання людини та тварин. Для диференціаціїP. malleiтаP. pseudomallei використовують ознаки, зазначені в таблиці 32.
Біопроба.Готують суспензію тканини на стерильному фізіологічному розчині (співвідношення 1:10) і вводять в об'ємі 0,5. 1 мл підшкірно в область шиї золотистим хом'ячкам або обсягом 3. 5 мл морським свинкам. Стерильно взятим матеріалом (пунктат) заражають тварин внутрішньочеревно. У позитивних випадках дома підшкірної ін'єкції утворюється виразка з ущільненими краями, розвивається кон'юнктивіт, риніт, у заражених внутрибрюшинно самців морських свинок — орхіт (феномен Штрауса). Загибель хом'ячків настає на 5. 7 добу, морських свинок - на 8. 15 добу або хвороба переходить в хронічну форму. Загиблих та вбитих тварин піддають бактеріологічному дослідженню.
Серологічна діагностиказаснована на результатах РЗК. Діагностичним титром сироватки вважають розведення 1:10 при затримці гемолізу на чотири або три хрести; затримку гемолізу на один, два хрести при розведенні сироватки 1: 10 і на три, чотири хрести при розведенні сироватки 1:5 оцінюють як сумнівний результат.
Алергічна діагностика. Метод, застосовуваний у господарствах контролю за добробутом коней по сапу (ставлять офтальмопробу чи внутрішньошкірну пробу з маллеином).
Біопрепарати. Маллеїн - діагностичний сапний алерген. При його виготовленні вирощують культуру збудника в гліцеринізованому бульйоні протягом чотирьох місяців, стерилізують автоклавуванням, фільтрують через фільтр Зейтца, контролюють на стерильність, нешкідливість на білих мишах,специфічність - на здорових конях, стандартизують за активністю в одиницях на лабораторних тварин.
Сапний антиген для РЗК готують наступним чином: агарову культуру збудника змивають фенолізованим фізіологічним розчином, стерилізують автоклавуванням, відстоюють. Як антиген використовують вільну від клітин культуральну рідину, перевірену на стерильність, специфічність і активність.
Позитивна сапна сироватка призначена для визначення активності антигену (РСК) і як контроль при постановці РСК. Отримують гіперімунізацією коней.
Меліоїдоз (хибний сап, хвороба Уітмора). Інфекційне захворювання тварин (коні, собаки, кролики, дрібна рогата худоба) та людини, що протікає у формі гострої або хронічної септицемії або септикопіємії.
Збудник - бактеріяPseudomonas pseudomallei,рідPseudomonas, сімейство Pseudomonadaceae.
Лабораторна діагностика меліоїдозу заснована на результатах бактеріологічного дослідження.
Бактеріологічне дослідженнявключає виявлення збудника у вихідному матеріалі методом світлової мікроскопії і біопроби, виділення чистої культури посівом на поживні середовища та ідентифікацію збудника за культурально-морфологічними, ферментативними і серологічними властивостями.
Матеріал для дослідження. У лабораторію направляють кров, мокротиння, сечу, гнійне відділення з абсцесів, ділянки уражених органів.
Мікроскопія препаратів із вихідного матеріалу. Збудник є поліморфною грамнегативною паличкою розміром (1,5. 6) х (9,5. 10) мкм, із закругленими кінцями, спор і капсул немає; лофотріх. У мазках-відбитках з органів розташовується поодиноко або компактнимискупченнями.
Виділення та ідентифікація культури збудника. Збудник – аероб, температурний оптимум 37 ºС, рН 6,8. 7,0, до поживних середовищ невибагливий. Досліджуваний матеріал висівають на агар і бульйон з гліцерином. При забрудненні матеріалу сторонньою мікрофлорою його обробляють пеніциліном (1000 ОД/мл).
На щільних середовищах через 24 години інкубування збудник формує дрібні, прозорі, пізніше каламутні білуваті колонії з металевим блиском, можуть з'являтися колонії Я-форми і великі (до 7 мм) М-форми. На кров'яному агарі, гліцеринізованих середовищах росте з утворенням колоній кремово-жовтогарячого кольору. На рідких середовищах через 24. 48 год викликає помутніння середовища, утворення плівки, яка після додавання нейтрального червоного набуває оранжево-червоного кольору. Для бульйонних культур характерний затхлий запах. Збудник у мазках із чистих культур розташовується одиночно, парами, короткими ланцюжками або скупченнями по 5. 7 штук.
У культур із типовими дляP. pseudomalleiкультурально-морфологічними ознаками досліджують ферментативні властивості. Збудник ферментує із утворенням кислоти глюкозу, сахарозу, лактозу, мальтозу, галактозу, дульцит; декстрин, що не утворює індол і сірководень, повільно розріджує желатину, згортає та пептонізує молоко, гідролізує аргінін.
Виділені культури також ідентифікують серологічних реакціях: РА, РНГА, РП.
Біопроба. Суспензією з матеріалу заражають внутрішньочеревно (0,5. 1,0 мл) щурів та морських свинок. У позитивних випадках тварини гинуть залежно від вірулентності штаму на 3. 15 добу. У самців морських свинок може розвинутись феномен Штрауса.
Як ознаки для диференціаціїP. malleiтаP. pseudomalleiвикористовують морфологічні критерії (див. табл.32), а також здатністьP.pseudomalleiсинтезувати на кров'яному агарі кремово-жовтогарячий пігмент, пептонізувати молоко, гідролізувати желатину, при зараженні викликати загибель щурів.
Псевдомоноз норок. Гостро протікає інфекційне захворювання. Характеризується геморагічною пневмонією, ознаками сепсису. Крім норок сприйнятливі лисиці, песці; у тварин інших видів збудник може спричиняти пневмонії, післяпологові, постхірургічні ускладнення.
Збудник псевдомонозу норок - бактерія Pseudomonas aeruginosa, рідPseudomonas,сімейство Pseudomonadaceae.
Лабораторна діагностика псевдомонозу норок заснована на результатах бактеріологічного дослідження.
Бактеріологічне дослідженнявключає виявлення збудника у вихідному матеріалі методом світлової мікроскопії, виділення чистої культури посівом на поживні середовища та ідентифікацію збудника за культурально-морфологічними, ферментативними і серологічними властивостями.
Матеріал для дослідження.До лабораторії направляють уражені ділянки легень, регіонарні лімфатичні вузли, селезінку, печінку, нирки.
Мікроскопія препаратів із вихідного матеріалу. P. aeruginosa у мазках, пофарбованих за Грамом, виявляють у формі прямих або вигнутих грамнегативних паличок довжиною 0,5. 1,4 мкм, шириною 0,2. 0,4 мкм, без капсул та спор; утворює джгутики. Розташовується у вигляді одиночних клітин, коротких ланцюжків.
Виділення та ідентифікація культури збудника. Збудник - аероб, температурний оптимум 35. 37 ° С, до живильних середовищ невибагливий. Досліджуваний матеріал висівають на МПА, МПБ.
Через 24 год зростанняP. aeruginosaв МПБпроявляється помутнінням середовища, утворенням поверхневої плівки та сірувато-білого осаду, за рахунок пігменту середовище забарвлене у синьо-зелений колір, у міру старіння культури колір колоній стає бурим. На МПА збудник формує в основному два типи колоній: великі (діаметр 2. 5 мм), напівпрозорі, сіруваті, гладкі, з плоскими краями та піднятим центром, а також дрібні шорсткі. Штами, виділені з респіраторного та сечостатевого тракту, можуть утворювати слизові колонії. Середовище навколо колоній забарвлено за рахунок пігменту у синьо-зелений колір. Збудник синтезує чотири типи пігменту: піоціанін (синьо-зелений або жовто-зелений), флуо-ресцеїн, піорубін та чорно-бурий пігмент. Для культивуванняP. aeruginosaпри первинній ізоляції з досліджуваного матеріалу використовують спеціальні селективні середовища з антибіотиками.
У виділених культур вивчають ферментативні властивості. ДляP. aeruginosaхарактерні такі ознаки: утворення аргініндигідролази, оксидази, гідроліз желатини, розщеплення глюкози, бета-аланіну, D-, L-аспарагіна, денітрифікація та здатність до зростання при 4l °С.
Вид гетерогенний по соматичних О-антигенів. Для ідентифікації на рівні О-серогрупи використовують РА на склі, причому досліджують лише культури, у яких відзначено мінімум дві з трьох фізіологічних ознак, характерних для виду: утворення пігменту піоціаніну, розщеплення глюкози, зростання при 41...42°С. Використовують набір із трьох полівалентних та одинадцяти моновалентних сироваток. Антигеном служить 18. 20-годинна агарова культураP. aeruginosa, інактивована кип'ятінням у водяній бані протягом 1,5 год [концентрація (3.5) * 109/мл]. Антиген спочатку досліджують з полівалентними сироватками, при отриманні позитивного результату - змоновалентними, що входять до складу тієї чи іншої полівалентної сироватки. Результат враховують за 3. 6 хв.
Біопрепарати. Моновалентну формолквасцову вакцину проти псевдомонозу норок готують наступним чином: культуру вакцинного штаму (Шостий серотип) вирощують на живильному середовищі, інактивують формаліном, адсорбують на галуну, контролюють на стерильність, без стерильності.
Діагностичні О-аглютинуючі сироватки для сіро-групової ідентифікаціїP. aeruginosaвключають три полівалентні сироватки: № 1 (03, 04, 05, 06, 07), № 2 (02, 08, 09), № 3 (010, 011, 012) і одинадцять відповідних моновалентних сироваток. Призначені для ідентифікаціїP. aeruginosa на рівні О-сіркогрупи.
ЗАВДАННЯ ДЛЯ САМОСТІЙНОЇ РОБОТИ
1. Ознайомитися з біопрепаратами для серологічної та алергічної діагностики сапу.
2.Вивчити морфологічні, тинкторіальні, культуральні та ферментативні властивостіP. aeruginosa.
3. Ознайомитись з біопрепаратами для специфічної профілактики та діагностики псевдомонозу норок.
1. Яке значення бактеріологічного дослідження для лабораторної діагностики сапу?
2. Які імунологічні методи застосовують для діагностики сапу?
3. Які біологічні властивості збудника псевдомонозу норок?
4. Які біопрепарати застосовують для специфічної профілактики псевдомонозу норок та серологічної ідентифікації збудника?
5. У чому полягає бактеріологічне дослідження на меліоїдозі?
Тема 35