Лабораторна робота 312

Лабораторна робота №312

Визначення арсеназо 1 і блакитного декстрану в їх суміші.

ФХМА, М. 2001р, стор 432-441

Коротке теоретичне введення:

Загальна характеристика методу

Гель-хроматографія, абогель-проникаюча,абоексклюзивна хроматографіяє одним з варіантів рідинної хроматографії, в якому розчинена хроматографована речовина розподіляється між розчинником, що оточує гранули сорбенту (рухлива фаза), і розчинником , що знаходяться всередині пор гранул сорбенту (нерухома фаза). Зважаючи на те, що сорбенти, що використовуються в гель-хроматографії, мають різні за розмірами пори, то поділ у даному випадку залежить від співвідношення розмірів молекул речовин і розмірів пір сорбенту. Крім розмірів, які можна у першому наближенні прийняти пропорційними молекулярним масам, істотну роль гель-хроматографії грає форма молекул. Особливо велике значення цей фактор має для розчинів полімерів, в яких при одній і тій же молекулярній масі молекули можуть набувати різної форми (сферичну або іншу) відповідно до їх конформаційної рухливості і внаслідок цього вони по-різному поводяться в колонці. Подальші міркування справедливі для молекул, що мають сферичну форму.

При проходженні через колонку компоненти суміші поділяються на фракції відповідно до їх молекулярних мас; першими вимиваються (елююються) найбільші молекули, особливо такі, у яких розміри молекул перевищують розміри пір сорбенту, так як вони не в змозі проникнути в пори і залишаються тільки в навколишньому сорбентшар розчинника (зовнішньому обсязі). При промиванні колонки розчинником швидкість руху таких молекул є максимальною. Молекули меншого розміру проникатимуть у пори повністю або частково (залежно від розміру пор), і весь процес поділу залежатиме, крім розміру пор сорбенту, від коефіцієнта дифузії молекул, що розділяються. Відповідно до рівняння Ейнштейна коефіцієнт дифузіїDHобернено пропорційний радіусу частинки r сорбенту:

де R - універсальна газова стала;Т-абсолютна температура; η - в'язкість середовища;NA—число Авогадро.

Залежно від властивостей хроматографованих сполук у гель-хроматографії застосовують гідрофільні або гідрофобні сорбенти з жорсткою, напівжорсткою та м'якою матрицею. В якості гідрофільних сорбентів використовують м'які декстранові гелі (сефадекси та молелекти), поліакриламідні гелі (біогелі), гідроксиалкілметакрилатні гелі (сферони), а також макропористі силікагелі та макропористі скла (жорсткі сорбенти). Як гідрофобні сорбенти застосовують деякі типи сефадексів, полістирольні гелі (стирогель, пора-гель), полівінілацетатні гелі і також силікагель і макропористе скло (порасил).

Основна вимога до роботи сорбентів у гель-хроматографії - виключити адсорбцію та іонний обмін речовин, що розділяються, тобто поділ повинен проходити тільки за рахунок розмірів молекул. Серед гідрофільних сорбентів найбільш застосовними є декстранові гелі – сефадекси. На прикладі сефадексу нижче розглянуті фізико-хімічні основи утримання в гель-хроматографії, які справедливі для будь-яких інших сорбентів у цьому хроматографічному методі.

Декстран - розчинний лінійний полісахарид з молекулярною масою до 10 млн., дужегідрофілен унаслідок високого вмісту гідроксильних груп. При частковому гідролізі у розведеній кислоті декстран розпадається на фракції, що мають різну молекулярну масу. Використовуючи реакцію декстрану з епіхлоргідрин, отримують тривимірний, нерозчинний у воді гель, званий сефадекс. Він випускається як гранул. Ступінь набухання та розміри пір у фракції сефадекса залежать, головним чином, від ступеня зшивки лінійного полімеру декстрану та його молекулярної маси. Чим сильніше набухання у воді фракцій сефадекса, тим більші розміри пір і тим більші за розміром молекули можна розділяти на цій фракції.

Сефадекси практично не надають хімічної дії на досліджувані речовини та не змінюють їх природи. Вони стійкі до органічних розчинників, до розбавлених розчинів кислот та лугів в інтервалі рН від 2 до 10.

Розчинник у колонці, заповненій сорбентом, наприклад гелем, складається з нерухомої фази (розчинник у порах гелю) та рухомої фази (розчинник між гранулами гелю). Загальний обсяг стовпчика гелю (об'єм колонки)Vtскладається із зовнішнього об'єму (об'єму розчинника між гранулами, тобто рухомої фази)Vo,внутрішнього об'єму (об'єму розчинника всередині гранул, тобто нерухомої фази)VHта об'єму сухого гелю (об'єму матриці) Vм:

Значення Vовизначають, пропускаючи по колонці високомолекулярну речовину, не здатну проникати в гранули гелю, тобто розмір молекул якого більший за розміри пор гелю. Об'єм розчинника, що пройшов через колонку від моменту внесення високомолекулярної речовини до моменту появи максимуму його концентрації в елюаті на виході колонки, точно відповідає зовнішньому об'ємуVo.ЗначенняVHвизначають за формулою:

деа -маса сухого гелю, г;S-ємність гелю по розчиннику, г/г гелю; р - густина розчинника, г/см 3 .

Якщо розміри молекул речовини значно менше пор гранул гелю і безперешкодно проникають всередину пор, то для таких молекул коефіцієнт розподілуКД= 1. Молекули речовини, які за своїми розмірами займають проміжне положення, можуть проникати в пори обмежено, тобто для них доступні не всі пори і, отже, не весь внутрішній обсяг гранул. Їх справедливе співвідношення: 0 >VM.Для таких гелів приймають, що не існують окремо пори та матриця, а є одна система, в якій і відбувається розподіл макромолекул.

Явища адсорбції та розподілу у гелях розділити дуже важко, і зазвичай обидва явища розглядають разом. Наприклад, низькомолекулярні ароматичні та гетероциклічні сполуки (фенол і піридин) сильніше затримуються в гранулах сефадекса, ніж це можна очікувати тільки внаслідок дифузії, тобтоVR>VRтеор,що, ймовірно, можна пояснити в деяких випадках утворенням водневих зв'язків між ОН-групами сефадекса і молекулами сполук, що розділяються. За відсутності взаємодії речовин з фазою гелюК2= 0 іК3=0 і загальне рівняння набуває первісний вигляд.

Елюенти.У гель-хроматографії елюенти (рухлива фаза) вибирають, головним чином, виходячи з вимог, щоб вони розчиняли речовини, що розділяються, і мали малою в'язкістю. Для гідрофільних речовин під час роботи з м'якими гелями використовуються водні розчини з певною іонною силою та рН. Для поділу полімерів, не розчинних у воді, застосовують органічні розчинникитакі, як тетрагідрофуран, диметилформамід, толуол та ін. Крім того, при виборі елюентів слід враховувати, що рухома фаза повинна бути сумісна з використовуваним сорбентом. Іноді заміна одного розчинника іншим призводить до досягнення поділу внаслідок взаємодії розчинника та речовин, що розділяються.

У розділі методом гель-хроматографії бере участь лише незначна частина обсягу колонки (Vt - Vо) (див. малюнок), тому кількість компонентів, яке можна розділити, обмежена. І, як наслідок, у гель-хроматографії застосовують досить довгі колонки, але в цьому випадку відбувається розмивання зон і збільшується ВЕТ. Особливо значно розмивання зони в колонці при поділі високомолекулярних речовин, так як на ВЕТТ впливає швидкість дифузії речовини всередину пір: чим більша молекулярна маса дифузної речовини, тим більший опір масопередачі (менше швидкість дифузії) при певній молекулярній масі воно досягає максимуму, а потім починає зменшуватися і стає рівним нулю коли розміри молекул стають більшими за розміри пор. Внаслідок цих причин максимальна кількість компонентів, що розділяються в гель-хроматографії в три рази менше, ніж на аналогічній колонці в газовій або рідинній хроматографії при рівній кількості теоретичних тарілок.

Гель-хроматографія широко застосовується в біохімії, синтетичній органічній хімії та хімії полімерів. Основні напрямки застосування гель-хроматографії такі.

1. Групове відділення високомолекулярних з'єднань від низькомолекулярних. У біохімії цей поділ називається знесолення. Цей метод дозволяє отримати чисті білки, нуклеїнові кислоти з великою молекулярною масою, причому низькомолекулярні солі, наприклад NaCl, затримуються в порах сорбенту.

2. Поділ (фракціонування) компонентів суміші, що розрізняються по молекулярних масах, але не настільки значно, як для зазначених у пункті 1. Наприклад, на сефадекс G-150 досягається поділ ферментів селезінки з молекулярними масами 100000, 45000 і 24000. У зв'язку з розробкою сорбентів особливо високої дисперсності гель-хроматографію все частіше застосовують для поділу низькомолекулярних сполук, наприклад, тригліцеридів вищих жирних кислот (М ≈ 200 - 500) в процесі фізико-хімічних перетворень олігомерів на полімери(М≈ 500 - 1 .

3. Визначення молекулярних мас білків, олігомерів, полімерів, вуглеводнів, що ґрунтується на лінійній залежності обсягів виходу речовин від молекулярної маси:

Кожен сорбент характеризується своєю градуювальною кривою, за якою знаходять молекулярні маси речовин.

Як калібрувальні сполуки (стандартів) використовують речовини, близькі за своєю природою до досліджуваних речовин. Так як на даній колонці обсяг виходу речовини відтворюється дуже точно, то спочатку через колонки пропускають стандартні речовини і визначають їх обсяги виходу, будують графік градуювання, а потім, знаючи VR речовини з невідомою молекулярною масою, знаходять її за графіком.

4. Тонкошарова гель-хроматографія знаходить широке застосування для визначення молекулярно-масового та композиційного розподілу полімерів, в клінічній діагностиці як експрес-метод для визначення патологічних білків у сироватці крові, спинномозкової рідини, для перевірки чистоти препаратів і т.д.

Поділ барвника арсеназо 1 (молекулярна маса 592,3) та нітрофенолу (молекулярна маса 139,1) на колонці з сефадексом G-25 відбувається внаслідок розходження їх молекулярних мас. Першим вимивається арсеназо 1, якмає велику молекулярну масу, а потім нітрофенол. Для визначення зовнішнього обсягу колонки (величинаVo)в аналізовану суміш додають високомолекулярний полісахарид-блакитний декстран (молекулярна маса до 2 млн.). Ця речовина вимивається з колонки у зовнішньому обсязі.

Кількісне визначення блакитного декстрану, арсеназо 1 і нітрофенолу проводять фотометрично за власним забарвленням.

Прилади та реактиви:

Хроматографічна колонка із сефадексом G-25 довжиною 45 см, діаметром 2,5 см.

Градуйовані пробірки місткістю 5 мл.

Склянки місткістю 100 мл.

Піпетки місткістю 1 мл.

Розчин NaOH, 20%-ний.

Аналізований розчин: суміш розчинів блакитного декстрану, арсеназо 1 та нітрофенолу, що містять по 1 мг/мл, підкислена двома краплями 2М СН3СООН.

Хроматографування аналізованої суміші.

Воду в колонці опускають рівня сефадекса.Не допускайте проскоку рідини нижче рівня сефадекса!Аналізований розчин (близько 2 мл) в один прийом обережно по скляній паличці вливають з бюкса в колонку, намагаючись не смутити верхній шар сефадекса. Одночасно під кран колонки підставляють мірний циліндр та відкривають кран. Бюкс двічі обполіскують дистильованою водою порціями близько 0,5 мл (5-10 крапель) і обережно переносять у колонку після вбирання аналізованого розчину в шар декстрану. Така обережність необхідна формування чіткої, нерозмитої зони. Після цього обсяг води, що вноситься у верхню частину колонки не має значення, і воду додають у міру її протікання через колонку.

У пробірки місткістю 5 мл починають збирати перші пофарбовані у блакитний колір краплі блакитного декстрану. Записують обсяг елюату (об'єм води вциліндрі). Усього відбирають проби об'ємом по 5 мл 22 пробірки.

Визначення блакитного декстрану та арсеназо 1.

Вміст пробірки (5 мл) переносять у кювету з товщиною поглинаючого шару

l=10 мм і вимірюють оптичну щільністьАна фотоелектроколориметрі з червоним світлофільтром(λ=630 нм) для блакитного декстрану та із зеленим світлофільтром(λ= 540 нм) для арсеназо 1. Як розчин порівняння використовують дистильовану воду.

---