Метилювання ДНК
Метилювання ДНК- це модифікація молекули ДНК без зміни самої нуклеотидної послідовності ДНК, що можна розглядати як частину епігенетичної складової геному [1] [2] [3] .
Метилювання ДНК полягає у приєднанні метильної групи до цитозину у складі CpG-динуклеотиду в позиції С5 цитозинового кільця. Метилювання в промоторній зоні гена зазвичай призводить до супресії відповідного гена. Метильований цитозин може потім окислюватися особливими ферментами, що зрештою призводить до його деметилювання назад в цитозин [4] .
Метилювання ДНК вважається, в основному, властивим еукаріотів. У людини метильовано близько 1% геномної ДНК. У соматичних клітинах дорослого організму метилювання ДНК зазвичай відбувається у CpG-динуклеотидах; метилювання ДНК поза CpG-динуклеотидів зустрічається в ембріональних стовбурових клітинах. [5] [6]
Більш того, метилювання ДНК поза CpG-динуклеотидами є відмінною рисою епігеному плюрипотентних стовбурових клітин, а зниження не-CG-метилювання пов'язане з порушенням здатності до диференціювання в ентодермальні лінії клітин [7]
У рослин метилювання цитозину відбувається як симетрично по обох ланцюгах (на CpG або CpNpG), так і асиметрично лише на одному з двох ланцюгів (на CpNpNp, де N позначає будь-який нуклеотид).
Зміст
Близько 60-70% всіх CpG-динуклеотидів у ссавців метильовано. Неметильовані CpG-динуклеотиди згруповані у т.з. "CpG-острівці", які присутні в 5'-регуляторних областях багатьох генів. Різні захворювання, наприклад рак, супроводжуються початковим аномальним гіпометилюванням ДНК і подальшим гіперметилюванням CpG-острівців у промоторних областях генів, що призводить до стійкої репресії.транскрипції. Репресія транскрипції в цьому випадку опосередкована білками, які можуть зв'язуватися з метильованими CpG-динуклеотидами. Ці білки, звані метилцитозин-зв'язуючими білками, залучають деацетилазу гістонів (HDAC) та інші фактори, що беруть участь у ремоделюванні хроматину. Комплекс, що сформувався, може модифікувати гістони, формуючи конденсовану транскрипційно неактивну структуру гетерохроматину. Вплив метилювання ДНК на структуру хроматину має велике значення для розвитку та функціонування живого організму. Зокрема, відсутність метилцитозин-зв'язуючого білка 2 (MeCP2) внаслідок, наприклад, мутації у відповідному гені, призводить до розвитку синдрому Ретта у людини; інактивація метилцитозин-зв'язуючого доменного білка 2 (Methyl-CpG binding domain protein 2 - MBD2), який бере участь у репресії транскрипції гіперметильованих генів, відзначена при онкологічних захворюваннях.
Метилювання ДНК у людини
Людина за процес метилювання ДНК відповідають три ферменти, звані ДНК-метилтрансферазами 1, 3a і 3b (DNMT1, DNMT3a, DNMT3b), відповідно. Передбачається, що DNMT3a і DNMT3b - це метилтрансферазиde novo, які здійснюють формуванняпатернуметилювання ДНК на ранніх стадіях розвитку, а також його зміни в процесі диференціювання клітин. Існує гіпотеза про те, що метилювання ДНКde novoвикликається, зокрема, інтерферуючими РНК за допомогою РНК-залежного метилювання ДНК - процесу, що виник під час еволюції з метою репресії мобільних елементів геному. [8] DNMT1 є ДНК-метилтрансферазою, яка підтримує метильований стан ДНК, приєднуючи метильні групи до одного з ланцюгів ДНК у точках, де інший, комплементарний їй ланцюг,метильована. Передбачається, що роль інгібіторів DNMT1, що регулюють метилювання ДНК, виконують неполіаденільовані довгі некодуючі РНК (lncRNA) [9] Білок DNMT3L гомологічне іншим DNMT-білкам, але не має каталітичної активності. Натомість DNMT3L підтримуєde novo-метилтрансферази, сприяючи зв'язуванню цих ферментів з ДНК і стимулюючи їх активність.
Важливими етапами розвитку злоякісних новоутворень є попереднє гіпометилювання ДНК [10] і подальша інактивація генів-супресорів пухлинного росту [11] . У разі коли інактивація була обумовлена метилюванням промоторної області гена, проводилися експерименти щодо відновлення експресії шляхом інгібування DNMT. 5-aza-2'-дезоксицитидин (децитабін) є нуклеозидним аналогом, що інгібує DNMT-метилтрансферази. Механізм дії препарату заснований на ковалентному зв'язуванні ферменту в комплексі з ДНК, що унеможливлює виконання ферментом своєї функції і призводить до деградації метилтрансферази. Однак для того, щоб децитабін був активний, він повинен вбудуватися в геном клітини, але це, у свою чергу, може викликати мутації в дочірніх клітинах, якщо клітина не гине і продовжує поділ. До того ж, децитабін токсичний для кісткового мозку, що звужує сферу його терапевтичного застосування. Ці обмеження призвели до інтенсивного пошуку методів терапевтичного впливу, що ґрунтуються на використанні «антисмислових» РНК, які протидіють DNMT за допомогою деградації її мРНК і, отже, блокують трансляцію. Можливість здійснити вибірково деметилювання гена і таким чином змінити його експресію дає відкриття так званої екстракодуючої РНК (extracoding RNA), яка здатна зв'язуватися з DNMT1, блокуючи його здатністьздійснювати метилювання конкретного гена [12]. Тим не менш, залишається відкритим питання про те, чи є інгібування функції DNMT1 достатньою умовою для збільшення експресії генів-супресорів, негативна регуляція транскрипції яких здійснюється метилюванням ДНК.
Аналіз персональних транскриптомів та метилломів людини показав, що кореляція між метилюванням та експресією генів спостерігається лише у менш ніж 20% генів [13]
Янг із співавт. розробили ефективний метод вибіркового цільового деметилювання конкретних CpG в клітинах людини з використанням об'єднаного шляхом молекулярної інженерії вибірково зв'язуючого ДНК домену TALE (transcription activator-like effector) і каталітичного домену TET1 гідроксилази, що каталізує перетворення 5-зинтицитокси4 в метил1 Використовуючи цю об'єднану молекулу TALE-TET1, вони показали, що деметилювання певних промоторів CpG може призвести до істотного збільшення експресії відповідних генів людини. Значно спростить створення виборчих деметилазів розробка ферменту на основі інактивованої молекули dCas9 (не здатної розрізати ДНК). Це дозволить спрямовувати деметилазу на вибрані для активації гіперметильовані генні промотори за допомогою напрямної РНК. [15]
Розроблено середовище, яке спричиняє гіпометилювання ДНК у клітинах in vitro. Це середовище, зване 2i, містить два низькомолекулярні інгібітори, один з яких інгібує сигнальний шлях ERK1/2, а інший Gsk3β. Вона широко використовується для перепрограмування та підтримки плюрипотентного стану клітин [16] [17] .
Зміни метилювання ДНК при старінні
Ще у 1970-х роках у роботах Ванюшина Б.Ф. та ряду інших співробітників біофаку МДУ булавиявлено взаємозв'язок етапів індивідуального розвитку та старіння тварин та людини зі змінами такої ферментативної модифікації як метилювання ДНК [18] . За цикл робіт «Метилювання ДНК – епігенетичний контроль за генетичними функціями організму» Ванюшину Б.Ф. було вручено премію імені А. Н. Білозерського.
У процесі старіння організму людини істотно знижується функціональний потенціал гемопоетичних стовбурових клітин (ГСК), що сприяє розвитку у людей похилого віку кровотворної патофізіології [30] . Це вікове зниження числа ГСК та їх здатність до проліферації, як виявилося, залежить переважно не від довжини теломер, а від гіперметилювання ДНК генів, регульованих Репресорним комплексом 2 білків Polycomb [31] .
На думку китайських дослідників [32], метилювання ДНК може сприяти здоровому старінню людини, регулюючи гени, сприйнятливі до вікових захворювань. Так, наприклад, при хворобі Альцгеймера активно експресується ген каспази 3 CASP3, яка бере участь у розщепленні білка-попередника бета-амілоїду 4A, що веде до загибелі нейронів, тоді як у довгожителів ген CASP3 заблокований шляхом гіперметилювання ділянки поблизу місця ініціації. Інший приклад: ген рецептора інтерлейкіну IL1R2 має низьку експресію у разі атеросклерозу, тоді як у довгожителів його активність не знижена завдяки гіпометильованій ділянці поблизу місця ініціації його транскрипції [32] [33] .
Див. також:Biological clock (aging), а також науково-популярний огляд українською [34] та докладний огляд англійською [35]
Роль метилювання в онкогенезі
Епігенетичний вік, як з'ясувалося, впливає на можливість захворіти на рак. Було розроблено алгоритм для обчисленняепігенетичного віку за даними метилювання ДНК крові Алгоритм ґрунтується на 71 маркері метилювання ДНК, які можуть змінюватися в залежності від навколишнього середовища, фізичних вправ і дієти. Дослідження за допомогою цього алгоритму колекції зразків крові, зібраних за 15 років, показало, що ті, у кого епігенетичний вік приблизно на один рік старший за їх хронологічний вік мають на 6% більший ризик захворіти на рак протягом трьох років, а ті, хто приблизно на 2 роки. ,2 роки старші за свій хронологічний вік мають на 17% підвищений ризик смерті від раку протягом п'яти років [36] [37] .
Зіставлення даних генотипу людей, схильних до онкологічним захворюванням, з профілем метилювання їх ДНК дозволило припустити, що у 20% випадків успадкованого раку виявляється взаємозв'язок між рівнем метилювання певних локусів і поліморфізмами генів, що з ризиком захворювання на рак. Зокрема, спостерігалася високо значуща кореляція між рівнем метилювання CpG та експресією ключових генів раку, таких як MYC, TERT та TP63 [38] .
Близько третини всіх великих пухлин пов'язано з мутацією гена KRAS або з мутаціями в шляхах пов'язаних KRAS. KRAS вимикає фермент TET1, який сприяє інактивації генів шляхом метилювання. TET1 каталізує початкову стадію активного залізо- та альфа-кетоглутарат-залежного деметилювання ДНК у ссавців - перетворення 5-метилцитозину (5-MC) на 5-гідроксиметилцитозин (5-HMC) окисленням 5-MC. Додавання до цих мутантних клітин TET1 активізує гени-супресори пухлини, що, як виявилося, достатньо, щоб зменшити аномальну проліферацію. Разом з тим, достатньо інактивувати TET1, щоб зробити ці клітини знову злоякісними, навіть без KRAS [39] .
Важливимбіомаркером онкогенезу є гіперметилювання CpG-острівців усередині промотору гена ZNF154 (zinc-finger protein 154) [40] [41] . Гіперметилювання ZNF154 спостерігалося у переважної більшості пухлинних клітин, але не було в нормальних клітинах [42] . Яку функцію в організмі виконує ген ZNF154, поки не ясно. Одночасно зазвичай спостерігається гіпометилювання у двох геномних областях, пов'язаних з Casp8 (каспаза-8) та VHL (супресор пухлин Гіппеля-Ліндау) [42] .
Рівень метилювання ДНК у улюбленого об'єкта генетиків Drosophila melanogaster дуже низький, що заважало його дослідженням методами бісульфітного секвенування [43] . Такама із співавт. [44] розробили високочутливий метод, який дозволив виявити, що профіль метилювання послідовностей ДНК геному мухи дуже відрізняється від профілю метилювання геному людини, тварин або рослин. Метилювання геному у дрозофіли зосереджено у певних коротких послідовностях основ (із 5 пар нуклеотидів), які багаті на CA та CT, але збіднені на гуанін. Крім того, воно, як виявилося, не залежить від активності DNMT2. Подальше вивчення метилювання ДНК у дрозофіли допоможе виявити вікові зміни епігеному.
Останнім часом відбувся значний прорив у розумінні процесу метилювання ДНК у рослин, особливо уArab &[45] Інші метилтрансферази ДНК також присутні у рослин, але їх функція поки не з'ясована (Див. [1]). Вважається, що специфічність метилтрансферази у процесі метилювання ДНК модулюється за допомогою РНК. Специфічні РНК-транскрипти транскрибуються з певних ділянок матриці – геномної ДНК. Ці РНК-транскрипти можуть формувати дволанцюгові молекули РНК. Дволанцюгові РНК, за допомогою регуляторних сигнальних шляхів, пов'язанихабо з малими інтерферуючими РНК (siRNA), або з мікроРНК (miRNA), детермінують локалізацію метилтрансфераз ДНК на ділянках специфічних нуклеотидних послідовностей у геномі [46].