Метод - пептидні карти - Велика Енциклопедія Нафти та Газа
Метод - пептидні картки
Метод пептидних карт є поєднанням паперової та тонкошарової хроматографії з високовольтним електрофорезом. Як носії використовують силікагель або порошок целюлози. Спочатку проводять хроматографію, для чого пробу наносять в точку поблизу однієї сторони паперу або пластинки, а потім під кутом проводять 90 високовольтний електрофорез. Метод застосовують для поділу суміші низькомолекулярних сполук. [1]
Метод пептидних карт на одному аркуші паперу слід розглядати швидше як аналітичний, ніж як препаративний. При препаративному поділі пептидів у тих самих умовах зазвичай суміш пептидів послідовно розділяється методами електрофорезу і хроматографії кілька прийомів, щоразу наносячи пробу на всю ширину паперу. Після проведення електрофорезу вирізають смуги паперу таким чином, щоб у середині та по трьох краях залишалися вузькі смужки паперу. Після прояву цих смужок нінгідрин вирізані смуги вставляються назад, і на них олівцем відзначаються пептидні зони. Подібні трудомісткі операції пов'язані з необхідністю мати достатньо речовини для подальшого аналізу. [2]
Розглянемо тепер метод пептидних карток. [3]
Швидшим методом поділу пептидів ензіматичного гідролізату є метод пептидних карт (відбитка пальців, або фінгерпринта), що поєднує високовольтний електрофорез і хроматографію на папері. За допомогою цього методу можливе зіставлення пептидних сумішей, одержуваних при розщепленні різних білків, і виявлення таких малих відмінностей в амінокислотному складі окремих пептидів, як заміщення одиничної амінокислоти будь-якої іншої. Такі відмінності мають велике значення при порівняльномувивченні гомологічних білків різних видів рослин та тварин, а також при визначенні генетичних змін у структурі білка, що виникають внаслідок точкової мутації. [4]
Отримані гідролізати аналізують різними методами: гель-хроматографією, іонообмінною хроматографією, електрофорезом і хроматографією на папері та в тонкому шарі, електрофорезом у поліакриламідному гелі, методом пептидних карт на папері або в тонкому шарі (в одному напрямку пептиди піддаються хроматографії) та ін. При цьому пептиди, що містять залишки аргініну, триптофану і гістидину, можуть бути відкриті за допомогою специфічних кольорових реакцій (с. Вибір методу диктується величиною (молекулярною масою) і характером пептидів гідролізату. [5]
При порівнянні отриманих пептидних карт різних Б виявляється, що всі ідентичні пептиди розташовуються в певних (одних і тих же) місцях, за винятком пептидів, по яких Б відрізняються один від одного Цим методом вперше виявлено, що при заміні одного залишку глутамінової до- ти в молекулі гемоглобіну на залишок валіну утворюється серповидноклітинний гемоглобін, що зустрічається при одному з видів анемії. Методом пептидних карток вивчають генетич. [6]
Дослідники зробили висновок, що гемоглобін S повинен містити трохи менше негативно заряджених R-груп, ніж гемоглобін А, Пізніше Вірною Інграм придумав досить простий експериментальний спосіб, що дозволяє більш точно локалізувати відмінності в поліпептидних ланцюгах гемоглобіну S і гемоглобіну А. Запропонований ним метод пептид понині широко використовується виявлення генетичних різновидів як гемоглобинів, а й інших білків. Інграм обробив обидва гемоглобіни, S і А, трипсином, який розриває тільки ті пептидні зв'язки,яких карбоксильна група належить залишкам аргініну або лізину (розд. Це призвело до утворення пептидних фрагментів 28 сортів, оскільки в а - і р-ланцюгах міститься загалом 27 залишків лізину і аргініну. Суміш пептидів, отриманих при розщепленні кожного гемоглобіну фільтрувальний папір, змочений буферним розчином, і підданий електрофорезу, внаслідок чого пептидні фрагменти розділилися, хоча і не повністю, на окремі зони.Після того як фільтрувальний папір був висушений, через нього пропустили буферний розчин з іншим значенням рН для хроматографічного поділу пептидних фрагментів у напрямку, перпендикулярному напрямку електрофорезу (розд. Коли папір був знову висушений і в прогрітому стані оброблена нін-гідрином (розд. Як видно з рис. 8 - 22, гемоглобін S відрізняється від гемоглобіну А за становищем на пептидних картах тільки однієї плями, з чого випливає, що в гемоглобіні S міститься лише один пептид, який відрізняється за своїм зарядом від відповідного пептиду гемоглобіну А. [8]
Високий відсоток у більшості білків лізину та аргініну призводить при гідроліз трипсином до появи порівняно великого числа відносно дрібних пептидів. Їх аналізують методом пептидних карток на папері або в тонкому шарі, а також за допомогою хроматографії на колонках та електрофорезом. [9]
Цим методом вперше виявлено, що при заміні одного залишку глутамінової кислоти в молекулі гемоглобіну на залишок валіну утворюється серповидноклітинний гемоглобін, що зустрічається при одному з видів анемії. Методом пептидних карток вивчають генетич. [10]
Фракціонування пептидів на іонообмінних смолах засноване на ряді принципів, про які вже говорилося вище (див. Сюди входять і відмінності в електрохімічнихвластивості фрагментів, що розділяються, і різна спорідненість неполярних радикалів до бензольних кільців матриці смоли, і зміна концентрації конкуруючих іонів у буферному розчині. Ця зміна концентрації іонів і рН може здійснюватися лінійно або східчасто. Елюйовані компоненти ідентифікують нінгідринової колориметрії, ліофілізують (висушують із замороженого стану) і перевіряють на гомогенність за допомогою хроматографії на папері та методом пептидних карт. Негомогенні піки фракціонують додатково. [11]