Молекулярна маса білків
Молекулярна маса білків
Білки відносяться до високомолекулярних сполук, до складу яких входять сотні та навіть тисячі амінокислотних залишків, об'єднаних у макромолекулярну структуру. Молекулярна маса білків коливається від 6000 (нижня межа) до 1000000 і вище залежно кількості окремих поліпептидних ланцюгів у складі єдиної молекулярної структури білка. Такі поліпептидні ланцюги отримали назву субодиниць. Їх мовляв. маса варіює у межах – від 6000 до 100000 і більше.
Амінокислотний склад та послідовність амінокислот з'ясовані для багатьох тисяч білків. У зв'язку з цим стало можливим обчислення їхньої молекулярної маси хімічним шляхом з високою точністю. Однак для величезної кількості білків, що зустрічаються в природі, хімічна будова не з'ясована, тому основними методами визначення молекулярної маси все ще залишаються фізико-хімічні методи (гравіметричні, осмометричні, віскозиметричні, електрофоретичні, оптичні та ін.). На практиці найчастіше використовуються методи седиментаційного аналізу, гель-хроматографія та гель-електрофорез. Визначення молекулярної маси білків методами седиментаційного аналізу проводять в ультрацентрифугах, в яких вдається створити відцентрові прискорення (g), що перевищують 200000 і більше разів прискорення земного тяжіння. Зазвичай обчислюють молекулярну масу за швидкістю седиментації молекул білка або седиментаційної рівноваги. У міру переміщення молекул від центру до периферії утворюється різка межа білковий розчинник (реєструється автоматично). Оптичні властивості розчинника та білка використовуються при визначенні швидкості седиментації; останню виражають через константу седиментації s, яка залежить від маси, так і від форми білкової частки:
де v – швидкість переміщення кордону розчинник-білок, см/с; ω – кутова швидкість ротора, рад/с; r - відстань від центру ротора до середини осередку з розчином білка, див. Константа седиментації має розмірність часу (виражають її в секундах). Величина константи седиментації, що дорівнює 1 • 10-13 с, умовно прийнята за одиницю і названа сведбергом (S). Значення констант седиментації більшості білків лежать у межах 1–50 S, хоча у деяких випадках ці значення перевищують 100 S.
Для обчислення молекулярної маси (М), крім константи седиментації, необхідні додаткові відомості про щільність розчинника та білка та інші відповідно до рівняння Сведберга:
де R - газова постійна, ерг/(моль град); Т - абсолютна температура (за шкалою Кельвіна); s – константа седиментації; ρ – густина розчинника; v - Парціальний питомий обсяг молекули білка; D – коефіцієнт дифузії.
Визначення молекулярної маси білків методом ультрацентрифугування вимагає багато часу та складної та дорогої апаратури. Тому в останні роки розроблено два простіші методи (гель-хроматографія та електрофорез). При використанні хроматографії гель в першу чергу потрібно відкалібрувати колонку. Для цього через колонку з сефадекс пропускають кілька білків з відомими молекулярними масами і будують графік, відкладаючи значення логарифмів молекулярної маси проти їх елюційних обсягів, які знаходять, як показано на рис. 1.9.
Відомо, що між логарифмом молекулярної маси білка, що має сферичну форму, та елюційним обсягом існує пряма залежність. Тому легко визначити молекулярну масу білка, що досліджується, знаючи його обсяг елюції. Другим різновидом цього методу є тонкошарова гель-хроматографія. Довжина пробігу білка (вміліметрах) через тонкий шар сефадекса знаходиться у логарифмічній залежності від молекулярної маси білка (рис. 1.10).
Мал. 1.9. Вимірювання обсягу елюції (VЕ).
Мал. 1.10. Залежність між довжиною пробігу білкових частинок при гель-хроматографії в тонкому шарі сефадекса Г-150 (надтонкого) та їх молекулярними масами (в напівлогарифмічній системі координат).
1 – рибонуклеаза; 2 – хімотрипсиноген; 3-яєчний альбумін; 4 - сироватковий альбумін; 5 - γ-глобулін; Х – білок з невідомою молекулярною масою.
Гель-хроматографія, крім простоти і швидкості, має додаткову перевагу: не потрібно виділяти білок у чистому вигляді, тому що домішки інших білків не заважають визначенню, оскільки кожен з них проходить через колонку зі властивою йому швидкістю, що визначається молекулярною масою. Ця обставина широко використовується в ензимології, коли виявляється можливим визначення молекулярної маси навіть дуже невеликої кількості ферменту в присутності інших білків, які не мають аналогічної каталітичної активності.
При використанні диск-електрофорезу в поліакриламідному гелі для визначення молекулярної маси білків також будують графік залежності між логарифмом молекулярної маси калібрувальних білків і рухливістю білкових частинок в поліакриламідному гелі, а потім, визначивши рухливість досліджуваного білка, 1 на графіку. Електрофорез проводять у присутності детергенту додецилсульфату натрію, тому що тільки в цьому випадку спостерігається пряма пропорційна залежність між молекулярною масою та рухливістю білків. Білки з четвертинною структурою за цих умов розпадаються на субодиниці, тому метод знаходить широке застосування визначення молекулярної маси субодиниць білка.
Мал. 1.11. Залежність між молекулярною масою та відносною рухливістю білка при дискелектрофорезі в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію (в напівлогарифмічній системі координат).
1 - сироватковий альбумін; 2 – яєчний альбумін; 3 – пепсин; 4 – хімотрипсиноген; 5 - міо-глобін; 6 - цитохром; Х – білок з невідомою молекулярною масою.
Нещодавно запропоновано новий мас-спектрометричний метод (так званий лазерний десорбційно-іонізаційний метод), що дозволяє визначати молекулярну масу невеликих пептидів (вазопресин, інсулін) та великих біополімерних молекул і, крім того, структуру біомолекул.
">