Нінгідриновий реактив - Технічний словник Том VII
Нінгідриновий реактив легко окислюється і темніє при освітленні та контакті з повітрям. Його слід зберігати на холоді, у темряві та під азотом. Навіть максимально короткі трубки подачі реактиву доводиться за допомогою спеціального покриття захищати від дифузії повітря через стінки. Для відновлення нінгідрину реактив іноді додають хлорид олова. Від нього в трубках поступово накопичується нерозчинний осад. Приготування нінгідринового реактиву: в посудину з помаранчевого скла місткістю 1 л поміщають 375 мл монометилового ефіру етиленгліколю (ТУ 6 - 09 - 08 - 4398 - 77), додають 125 мл натрій-ацетатного буферного мішалці пропускають азот протягом 10 хв, потім додають 10 г нінгідрину і знову пропускають азот протягом 10 хв, продовжуючи перемішування на магнітній мішалці до повного розчинення нінгідрину. Після цього додають 019 г олова дволористого 2-водного і перемішують. Приготування нінгідринового реактиву: 40 мг SnQ2 2Н2О розчиняють у 25 мл цитратного буферного розчину і додають 4 0 мг нінгідрину, попередньо розчиненого в 12 5 мп метилцелозольву. Прояв проводять нінгідриновим реактивом. Потім скляну пластинку з адсорбентом нагрівають у сушильній шафі 30 хв при 110 С. Хрома-тограму аміну виявляють нінгідриновим реактивом, причому після змочування нінгідрином потрібно нагрівати папір 5 хв при 105 С для отримання інтенсивного фіолетового забарвлення. Схема нінгідринового аналізатора, виготовленого з автоаналізатора фірми Technicon Chromatography Co. Далі до проби додається нінгідриновий реактив, аналогічний за складом, описаним на стор. Для визначення проліну готують нінгідриновий реактив, що містить 40 мл 6 М Н3Р04, 60 мл крижанийоцтової кислоти та 2 5 г нінгідрину на кожні 100 мл суміші. Для розчинення нінгідрину цю суміш нагрівають до 70 водяній бані. Схема нінгідринового аналізатора, виготовленого з автоаналізатора фірми Technicon Chromatography Co. Далі до проби додається нінгідриновий реактив, аналогічний за складом, описаним на сторінці. Важливою особливістю роботи автоматичного апарату є постійне тло: 0 001 одиниць оптичної щільності до і після кожного піку. Вже з 1/10 мкмоль розчиненої речовини можна отримувати задовільні результати; через відмінну відтворюваність обсягів витікання вдається ідентифікувати компоненти суміші, присутні в низьких концентраціях. Застосування тонкошарової хроматографії для перевірки препаративного поділу на колонках (з дозволу Am. Chem. Soc.. Невелика кількість амінокислот, що перейшла на неї, елюювали нінгідриновим реактивом. Поділені на секції зони аналізували далі методом ТСХ. Розен [16] П'є і Морріс [30], внісши деякі зміни до складу нінгідринового реактиву, що дозволяють отримувати більш стабільні результати і до того ж спрощують методику.
Пробу (0,5 мл), якщо необхідно, розбавляють буфером ще до 2 мл і змішують з 2 мл нінгідринового реактиву. Петрі; 7) NaHCO3; 8) 5%-на PbNO3 або РЬ (СН3СОО) 2; 9) реактив Сальковського; 10) реактив Ерліха; 11) нінгідриновий реактив; 12) реактив Несслер; 13) гумусний ґрунт; 14) свіже листя люпину або засушене листя інших бобових; 15) рибне, м'ясне борошно абошматочки м'яса, риби. Цакапати культуральний розчин на фільтрувальний або хро-матографічний папір мікропіпеткою з відтягнутим носиком (10 - 20 крапель в одну точку), підсушити над вентилятором, капнути реактив Сальковського, Ерліха або нінгідринового реактиву. Реактив Ерліха дає з індольними похідними пурпурне забарвлення. Два методи синтезу амінокислот. Зручною кольоровою реакцією на амінокислоти є взаємодія з нінгідрином (рис. 12.5); продукт реакдки сильно сполучений і тому інтенсивно забарвлений. Нингидриновый реактив використовують виявлення амінокислотних плям при хроматографії на пластинках чи папері, і навіть для колориметричного кількісного визначення амінокислот. Елююючі буферні розчини відводяться із запасних бутлів через пристосування для деаерації та нагнітаються через іонообмінні колонки з постійною швидкістю. Нінгідриновий реактив подається насосом в потік, що відтікає, в точці А, суміш елюату з нінгідрином проходить по спіралі з тефлону через киплячу водяну баню для розвитку забарвлення, що утворюється при взаємодії амінокислот з нінгідрином. Величини екстинкції забарвленого розчину безперервно вимірюються у фотометричній установці з самописним приладом, / - олія; 2 - приєднання до водяної лазні (50); 3 – тиск повітря 25 см; 4 - іонообмінні колонки; 5 – резервуар для нінгідрину; 6 – азот; 7 – повітря; S - олія; 9 – хронометр для соленоїда; 10 - покажчик рівня; // - Полиця, розташована вище деаератора на 20 см; 12-деаератор; 13 - кран, що регулюється соленоїдом; 14-насос 1; 15 - насос 2; 16 - насос 3; 17 - багатоходовий кран; 18 – резервуар для буфера; 19 - нагрівач; 20 -змійовик з тефлону; 21 – фотометр; 22-стік до зливу; 23 – вимірювальні прилади; 24 - вимірювач швидкості струму; 25-повітряний тиск 10 см;26 – лічильник часу; 27 - реєструючий апарат-самописець. Поряд з нінгідриновим реактивом існують інші реагенти, що дають кольорові продукти з деякими амінокислотами. Цю властивість вибіркового фарбування часто використовують у хроматографії для ідентифікації окремих амінокислот. Так, для визначення сполук із гуанідиновою групою (аргінін) використовують реакцію Сакагуші. За цим методом суміш пептидів наноситься в центрі листа хроматографічного паперу, проводиться електрофорез в буфері з рН 3 6 або 6 5, отримана смуга обробляється парами надмурашиної кислоти для переведення залишків напівцистину в цистеїнову кислоту, і потім повторно проводиться електрофорез , але у перпендикулярному напрямку. При прояві одержаної карти нінгідриновим реактивом пептиди, що містять цистеїнову кислоту, виявляються поза діагоналі. Реакція фарбування йде за описаною схемою для всіх амінокислот, крім проліну, який є імінокислотою. Однак пролін теж реагує з нінгідриновим реактивом, утворюючи досить забарвлений продукт з неявно вираженим максимумом поглинання при 440 нм. У зв'язку з цим сучасні амінокислотні аналізатори оснащуються денситометрами, що реєструють поглинання розчину (після реакційної спіралі) одночасно на двох довжинах хвиль: 570 і 440 нм. Метод визначення залишків акрексу та каратану, запропонований М. А. Клісенко та А. М. Шмігідіною (ВНДІГІНТОКС), заснований на виділенні органічним розчинником, його відгоні та хроматографуванні в тонкому шарі силікагелю КСК з цинковим пилом. Плями виявляють відновленням продуктів до аміносполук, що проявляються нінгідриновим реактивом. NaOH та вміст їх висушують у вакуумі протягом ночі. Після цього в пробірки вливають по 1 мл оцтової кислотипо 1 мл нінгідринового реактиву. Вміст пробірок нагрівають на водяній бані при 100 протягом 1 години, додають пробірки по 1 мл оцтової кислоти і охолоджують до кімнатної температури. Після цього рожеву рідину переносять інші пробірки і залишки пігменту екстрагують з паперу крижаною оцтовою кислотою. Визначення оптичної щільності проводять на спектрофотометр при 515 М х або на фотоелектроколориметр ФЕК-М при синьому світлофільтрі в порівнянні з контролем. Для приготування контрольних розчинів використовують шматочки паперу, вирізані з тих же ділянок хроматограм, що і плями пролина, що визначаються. Після підігріву пробірок стійке рожеве забарвлення зберігається лише протягом години, тому колориметрування необхідно проводити протягом цього часу. Розподіл амінокислот та інших важливих аміносполук показано на фіг. У 18 випадках нанесені на папір амінокислоти виявлялися при спектрофотометрическом визначенні за допомогою модифікованого нінгідринового реактиву (див. стор. Для гліцину і серину після хро-матографування у зворотному напрямку вирізаної ділянки хроматограми, виявленої розчинником П - Е - ФФ, були отримані фото відповідно 82 і 75% величин, знайдених при прямому аналізі зразків. Метод заснований на екстракції пестициду з досліджуваної проби органічним розчинником, відгону розчинника, хроматогра-фування проби в тонкому шарі силікагелю КСК з цинковим пилом.Виявлення зон локалізації препаратів на пластинах при нагріванні відновленням їх до аміносполук та проявом останніх нінгідриновим реактивом. Прилад і паперовий диск для кругової хроматографії.У ряді випадків для збереження забарвлення вже виявлену хроматограму обприскують другим реагентом або вводять відповідне з'єднання в початковий розчин реагенту-індикатора. Наприклад, при детектуванні плям амінокислот нінгідрином утворюються пурпурові плями, що вицвітають при кімнатній температурі протягом одного дня. Якщо вихідний нінгідриновий реактив ввести ацетат кадмію або після детектування нінгідрином обприскати плями розчином ацетату нікелю, забарвлення зберігається п'ять років.