Нова тест-система «ДС-ІФА-ВІЛ-АТ
Є. М. БАРАНОВА, І. Н. ШАРІПОВА, Є. Н. КУДРЯВЦЄВА, О. А. ЛОБАНОВА, В. Ф. ПУЗИРЄВ,
С. А. РЯБІНІНА, О. М. БУРКОВ, О. П. ОБРЯДІНА, Т. І. УЛАНОВА
«Діагностичні системи», Нижній Новгород
Московський обласний науково-дослідний клінічний інститут
НОВА ТЕСТ-СИСТЕМА «ДС-ІФА-ВІЛ-АТ/АГ-СПЕКТР» ДЛЯ ВЕРИФІКАЦІЇ ДОСЛІДЖЕНЬ НА МАРКЕРИ ВІЛ ІНФЕКЦІЇ
Серологічна діагностика ВІЛ інфекції в Україні будується на виявленні сумарного спектру антитіл проти антигенів ВІЛ за допомогою імуноферментних тест-систем
3 покоління, або одночасному виявленні антитіл і вірусного антигену р24 тест-системами 4 покоління. Для верифікації результатів ІФА в Україні використовують метод імунного блоттингу (ІБ), який дозволяє виявляти антитіла до окремих білків ВІЛ.
Однією з основних проблем лабораторної діагностики ВІЛ-інфекції є
інтерпретація результатів аналізу зразків, серопозитивних в ІФА, та негативних або «невизначених» в ІХ. Причинами невизначених або негативних результатів можуть бути:
-
Рання та пізня стадії ВІЛ інфекції, коли рівень антитіл низький, в ІБ виявляються антитіла лише IgG класу, а підтвердження наявності антигену р24 не передбачено; Крос-реактивність між ВІЛ-1 та ВІЛ-2; Крос-реактивність з іншими антигенами, не пов'язаними з ВІЛ
При отриманні «невизначеного» результату ІБ пацієнта ставлять на диспансерний облік та обстежують на наявність антитіл у динаміці. Це подовжує загальний час та вартість тестування.
З метою вдосконалення алгоритму підтвердження ВІЛ інфекції у «Діагностичні системи» (НижнійНовгород) була розроблена нова імуноферментна тест-система планшетного формату «ДС-ІФА-ВІЛ-АТ/АГ-СПЕКТР», призначена
для роздільного виявлення антитіл до окремих білків ВІЛ 1 та 2 типів та антигену
р24 в аналізованому зразку.
Матеріали і методи.У процесі розробки для оцінки специфічності тест-системи були використані зразки сироваток крові здорових донорів, зразки сироваток крові хворих на різні інфекційні захворювання, не пов'язані з ВІЛ, зразки сироваток крові хворих на різні неінфекційні захворювання, зразки сироваток крові вагітних жінок (n=3243); стандартна негативна панель сироваток ВЗГ 2П (-біологічний Союз», Новосибірськ)
Для оцінки чутливості тест-системи використовували стандарт HIV 1 ANTIGEN STANDARD (BIO RAD, Франція); стандартну панель сироваток ВЗО 5 (-біологічний Союз, Новосибірськ); стандартні панелі сироваток ВЗГ 2П, ВЗО 2 (-біологічний Союз», Новосибірськ); зразки сироваток крові ВІЛ-інфікованих (n=800); зразки сироваток крові, позитивних в ІФА та невизначених або негативних в ІХ, досліджені в динаміці (n = 18). Порівняльну оцінку розробленої тест-системи «ДС-ІФА-ВІЛ-АТ/АГ-СПЕКТР» здійснювали за допомогою «Блот-ВІЛ» (, Україна) та «New
Lav Blot 1» («Bio-Rad», Франція).
Результати та обговорення.Діючим початком розробленої тест-системи є: рекомбінантні антигени, аналогічні структурним білкам ВІЛ-1 – gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp41 (env) ВІЛ-1 та ВІЛ-1 групи О, ВІЛ-2 – gp36 (env); моноклональні антитіла миші до антигену ВІЛ-1 р24 gag, сорбовані окремо на стрипах
полістиролового розбірного планшета; кон'югати – рекомбінантні антигени та
моноклональні антитіла, мічені біотином тастрептавідин, мічений пероксидазою.
Схема проведення аналізу являє собою одностадійний «сендвіч» варіант з
поетапним внесенням кон'югатів, що дало змогу значно збільшити чутливість аналізу за рахунок процесу ампліфікації сигналу при взаємодії біотину зі стрептавідин-пероксидазою. Розроблено систему візуальної оцінки внесення всіх компонентів та зразків.Відсутність етапу промивання планшета між двома стадіями дозволило зробити постановку аналізу зручнішою і скоротити загальний час аналізу до 1 год 25 хв.
Проведені дослідження показали, що специфічність тест-системи "ДС-ІФА-ВІЛ-АТ/АГ-СПЕКТР" на стандартній панелі негативних зразків - 100%. При дослідженні зразків сироваток крові здорових донорів та хворих на різні інфекційні та неінфекційні захворювання специфічність тест-системи склала 99,5%.
Чутливість тест-системи ДС-ІФА-ВІЛ-АТ/АГ-СПЕКТР при виявленні антитіл на стандартних панелях сироваток, що містять антитіла до ВІЛ 1 і 2 типів склала 100%. Чутливість тест-системи при детекції антигену р24-7-5 пг/мл. При дослідженні зразків крові пацієнтів (n=800), підтверджених ІБ як ВІЛ-1 позитивні, було показано, що всі зразки позитивні і в тест-системі «ДС-ІФА-ВІЛ-АТ/АГ-СПЕКТР».
Для дослідження в тест-системі «ДС-ІФА-ВІЛ-АТ/АГ-СПЕКТР» було відібрано 18 зразків, позитивних в ІФА та «невизначених» (16 зразків) або негативних
(2 зразка) при первинному тестуванні в ІХ. При дослідженні динаміці ці зразки продемонстрували в ІБ позитивний результат.
В результаті досліджень цих зразків при первинному тестуванні у тест-системі «ДС-ІФА-ВІЛ-АТ/АГ-СПЕКТР» 17 визначені як позитивні, 1 як «невизначений». У 4 зразкахвиявлено лише антитіла, у 14 зразках – антиген р24 у поєднанні з антитілами або без них. Важливо, що у 2 зразках, мають негативний результат ІБ, визначається лише антиген р24. Високий відсоток виявлення р24 у зразках з невизначеним результатом доводить необхідність використання маркера ранньої стадії ВІЛ інфекції при підтвердженні позитивних результатів скринінгу.
Наведені нами дані показують, що розроблена тест-система ДС-ІФА-ВІЛ-АТ/АГ-СПЕКТР є ефективним інструментом для підтвердження позитивних результатів скринінгу і може бути використана на заключному етапі лабораторної діагностики ВІЛ-інфекції.