Поліпептиди модифікованого гормону росту, Банк патентів
Винахід відноситься до галузі біотехнології, безпосередньо до отримання модифікованого гормону росту, і може бути використане в медицині. Рекомбінантним шляхом одержують поліпептид, який має антагоністичну активність щодо рецептора гормону росту. Винахід дозволяє отримати поліпептид, який є ефективним при лікуванні станів, обумовлених надлишком гормону росту в організмі пацієнта. 6 н. та 5 з.п. ф-ли, 19 іл., 2 табл.
Винахід відноситься до злитих білків модифікованого гормону росту та димерів, що містять зазначені злиті білки, молекул нуклеїнових кислот, що кодує зазначені білки, та способів лікування, що включають застосування зазначених білків.
Гормон росту (GH) являє собою анаболічний гормон-цитокін, важливий для зростання в довжину в дитячому віці та нормальної конституції у дорослих. Регуляція активності GH складна і включає кілька взаємодіючих поліпептидних та пептидних агоністів та антагоністів. GH може надавати свої ефекти або безпосередньо, зв'язуючи рецептор гормону росту, або опосередковано, стимулюючи утворення інсуліноподібного фактора росту-1 (IGF-1). Таким чином, головною функцією GH є стимуляція утворення IGF-1 печінкою. Крім того, секрецію GH контролюють два пептидні гормони з протилежною активністю. Рилізинг-фактор гормону росту (GHRH) є пептидом з 44 амінокислот, утворений дугоподібним ядром гіпоталамуса. Він функціонує, стимулюючи утворення GH передньою часткою гіпофіза. Соматостатин є пептидним гормоном, що протидіє ефектам GHRH, і є результатом процесингу більшого пре-пропептиду з утворенням форм з 14 і 28 амінокислот. Нейроендокринні клітини перивентрикулярного ядрагіпоталамус секретують соматостатин в гіпоталамо-гіпофізарну систему ворітної вени, що з'єднує гіпоталамус з передньою часткою гіпофіза, де соматостатин інгібує секрецію GH.
GH послідовно зв'язується з двома мембранозв'язаними рецепторами гормону росту (GHR) через два окремих сайти на GH, званих сайт 1 і сайт 2. Сайт 1 є сайтом зв'язування з високою афінністю, а сайт 2 є сайтом зв'язування з низькою афінністю. Одна молекула GH зв'язує GHR 1 через сайт 1. Потім відбувається залучення другого GHR через сайт 2 з утворенням комплексу GHR:GH:GHR. Потім відбувається інтерналізація комплексу і він активує каскад сигнальної трансдукції, що призводить до змін експресії генів. Позаклітинний домен GHR існує у вигляді двох зв'язаних доменів, кожен з яких містить приблизно 100 амінокислот (SD-100), при цьому C-кінцевий домен SD-100 (b) розташований найближче до поверхні клітини, а N-кінцевий домен SD-100 (а) розташований на найбільшому віддаленні. При зв'язуванні гормону відбувається конформаційна зміна цих двох доменів з утворенням тривимірного комплексу GHR-GH-GHR.
Надлишок GH асоційований з декількома хворобливими станами, наприклад, акромегалією та гіпофізарним гігантизмом. Більшість випадків надлишку GH є результатом пухлини гіпофіза із соматотрофних клітин передньої частки гіпофіза. Ці пухлини є доброякісними та поступово збільшують секрецію GH. Симптоми надлишку гормону росту включають потовщення кісток щелепи, пальців рук та ніг, здавлення нервів/м'язів та інсулінорезистентність. Основним лікуванням надлишку GH, пов'язаного з пухлиною, є хірургічне видалення пухлини гіпофіза. Останнім часом застосування антагоністів GH для інгібування GH-сигналізації стає кращим лікуваннямчерез його неінвазивний характер. Антагоністи GH можуть бути або рекомбінантними формами соматостатину, або аналоги соматостатину (наприклад октреотид, ланреотид), або модифікований GH.
Огляд антагоністів, що є модифікованим GH, наведено в Kopchick (2003) European Journal of Endocrinology 148; S21-25, де описаний наявний у продажу антагоніст GH, званий пегвісомант, в якому комбінують модифікацію людського GH в положенні G120 з приєднанням поліетиленгліколю для збільшення молекулярної маси модифікованого GH. Проблема, пов'язана із введенням гормону росту, полягає у його швидкому кліренсі нирковою фільтрацією та/або протеолізом. Приєднання поліетиленгліколю зменшує ці втрати. Тим не менш, відомо, що поліетиленгліколь зменшує афінність GH щодо GHR, і, таким чином, для компенсації такої зниженої афінності необхідно вводити збільшені кількості модифікованого GH. Це може спричинити побічні ефекти. Буде бажаним надати антагоніст, що є модифікованим GH, який можна вводити в меншій дозі, уникаючи, таким чином, проблем, пов'язаних з пегвісомантом. Це може полягати або в зменшенні кількості, що вводиться, або в зниженні частоти введення.
Згідно з одним аспектом винаходу запропонована молекула нуклеїнової кислоти, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, вибрану з:
1) послідовності нуклеїнової кислоти, як представлено SEQ ID NO: 1;
2) послідовності нуклеїнової кислоти, як представлено SEQ ID NO: 2;
3) послідовності нуклеїнової кислоти, як представлено SEQ ID NO: 4;
4) послідовності нуклеїнової кислоти, як представлено SEQ ID NO: 5;
5) послідовностінуклеїнової кислоти, як представлено SEQ ID NO: 7;
6) послідовності нуклеїнової кислоти, як представлено SEQ ID NO: 8;
7) послідовності нуклеїнової кислоти, як представлено SEQ ID NO: 10;
8) послідовності нуклеїнової кислоти, як представлено SEQ ID NO: 11;
9) послідовності нуклеїнової кислоти, як представлено SEQ ID NO: 13;
10) послідовності нуклеїнової кислоти, як представлено SEQ ID NO: 14;
11) послідовності нуклеїнової кислоти, як представлено SEQ ID NO: 16;
12) послідовності нуклеїнової кислоти, як представлено SEQ ID NO: 17;
13) послідовності нуклеїнової кислоти, як представлено SEQ ID NO: 19;
14) послідовності нуклеїнової кислоти, як представлено SEQ ID NO: 20;
15) послідовності нуклеїнової кислоти, як представлено SEQ ID NO: 22;
16) послідовності нуклеїнової кислоти, як представлено SEQ ID NO: 23;
17) молекули нуклеїнової кислоти, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, що гібридизується в строгих умовах гібридизації з SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 12, 2 або 23;
і поліпептид, що кодує, має антагоністичну активність щодо рецептора гормону росту.
Гібридизація молекули нуклеїнової кислоти відбувається при утворенні безлічі водневих зв'язків між двома комплементарними молекулами нуклеїнових кислот. Суворість гібридизації може варіювати відповідно до умов середовища, що оточує нуклеїнові кислоти, характеру способу гібридизації і складу і довжиною використовуваних молекул нуклеїнових кислот. Обчислення щодо умов гібридизації, необхідних для досягнення певних ступенів суворості, обговорені вSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001); та Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York, 1993). Tm є температурою, при якій 50% даного ланцюга молекули нуклеїнової кислоти гібридизується з її комплементарним ланцюгом. Далі представлений приблизний ряд умов гібридизації, і він не є таким, що обмежує.
Дуже суворі умови (допускають гібридизацію послідовностей, що мають щонайменше 90% ідентичність)